我國(guó)具有悠久的飲茶歷史。傳統(tǒng)意義上的茶葉由于含有茶多酚，其抗氧化、清除自由基的功能已為人們所熟知。茶多酚是一一類多酚類化合物，它作為茶葉中的主要有效成分，占茶葉干重的30％左右，其來(lái)源廣泛。近年來(lái)研究表明，茶多酚具有多種藥理效應(yīng)，如降脂、防止血栓形成和抗衰老、抗心肌缺血等作用。綠茶富含茶多酚和茶多糖，具有很好的保健作用，因此近年來(lái)作為一種暢銷茶飲料走入人們的生活。本實(shí)驗(yàn)以綠茶為材料，觀察了綠茶提取物對(duì)Ⅱ型糖尿病大鼠糖耐量的影響，探討其對(duì)α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的抑制作用及對(duì)兔刷狀緣囊泡葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)能力的抑制作用，以期為揭示綠茶的降糖作用機(jī)理提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

綠茶，湖北省宣恩縣五家臺(tái)茶廠生產(chǎn)的級(jí)外炒青綠茶。酵母α-葡萄糖苷酶(來(lái)源Saccharomycessp.)日本和光公司；豬α-胰淀粉酶(type1-A)Sigma公司；大鼠胰島素酶免試劑盒法國(guó)SPI-BIO公司。

IWAKIREN-1型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；EYELAFDU-830型冷凍下燥儀；德國(guó)Bayer微量血糖測(cè)定儀：HITACHIU-2010型紫外分光光度儀；Wallac1209Rackbeta閃爍記數(shù)器。

1.2 綠茶提取物的制備

100g綠茶用2L蒸餾水浸泡過(guò)夜。過(guò)濾后濾渣重復(fù)提取三次。將提取液合并后，減壓蒸餾、冷凍干燥得綠茶干粉。其茶多酚含量為37.9％(酒石酸亞鐵比色、法)，茶多糖為6.1％(蒽酮硫酸法)。

1.3 動(dòng)物分組及糖耐量和胰島素測(cè)定

取16只GK/Jcl雄性大鼠(Ⅱ型糖尿病模型日本株式會(huì)社)，體重為259～28lg，隨機(jī)分為兩組。實(shí)驗(yàn)組大鼠以0.5g/kg劑量灌胃綠茶提取物同時(shí)灌胃蔗糖或淀粉，對(duì)照組則以蒸餾水代替綠茶提取物。糖耐量測(cè)定方法是，斷食16h后，灌胃蔗糖2g/kg或可溶性淀粉2g/kg，在0、0.5、1和2h用微量血糖測(cè)定儀測(cè)定血糖。胰島素測(cè)定按試劑盒說(shuō)明常規(guī)進(jìn)行。

1.4 α-葡萄糖苷酶抑制活性的測(cè)定

α-葡萄糖苷酶的抑制活性的測(cè)定采用渡邊等的方法。將α-葡萄糖苷酶溶于含有1g/L牛血清白蛋白的pH7.0100mmol/L磷酸緩沖液中作為酶液，4-硝基酚-α-D-吡喃葡萄糖苷溶于相同緩沖液中作為底物液。取10μl樣品、240μl(0.053U)酶液和750μl底物液，在37℃反應(yīng)15min。用0.5mlTris溶液停止反應(yīng)，測(cè)A_400nm和IC₅₀值(IC₅₀定義為抑制酶活性50％時(shí)所需的抑制劑濃度)。

1.5 α-淀粉酶抑制作用的測(cè)定

將10μl淀粉酶溶于4ml含有50mmol/LNaCl、5mmol/LCaCh、0.5g/LTritonX-100的pH6.925mmol/LPiperazine-N，N’-bis2-ethanesulfonicacid(PIPES)緩沖液中作為酶保存液，測(cè)定時(shí)用緩沖液稀釋40倍使用。反應(yīng)體系由650μlPIPES緩沖液、50u1樣品液、100μl酶液和200μl25g/L可溶性淀粉溶液組成，在37℃反應(yīng)10min，用0.5ml100ml/L乙酸溶液停止反應(yīng)，碘法測(cè)定A_700nm和IC₅₀值。

1.6 刷狀緣囊泡葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)能力的測(cè)定

將兔小腸浸泡于300ml含200mmol/L甘露醇的pH7.42mmol/LHEPES[N-(2-hydroxyethyl)piperazine-N’-(2-ethanesulfonicacid)]Tris緩沖液中，刮取小腸黏膜，在冰浴中高速勻漿2min。勻漿液中加0.619固體MgCl2，冰浴攪拌20min后，在4℃3000×g離心15min，所得上清在4℃3500×g再離心30min。此沉淀用10ml含100mmol/L甘露醇、0.1mmol/LMgS04的pH7.42mmol/LHEPES-Tris緩沖液溶解，在4℃35000×g離心40min，所得沉淀用3倍體積含300mmol/L甘露醇、0.1mmol/LMgS04的pH7.4 10mmol/LHEPES.Tris緩沖液重新溶解，用25號(hào)注射針頭反復(fù)抽吸，即得刷狀緣囊泡懸液。以³H-D-葡萄糖為底物，用快速過(guò)濾法測(cè)定刷狀緣囊泡葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)能力。抑制葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)活性50％時(shí)所需的抑制劑濃度定義為IC₅₀。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)均以X±S表示，并采用統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 綠茶提取物對(duì)糖尿病大鼠糖耐量及血胰島素水平的影響

蔗糖或可溶性淀粉負(fù)荷后2h，糖尿病大鼠血糖水平較對(duì)照組明顯降低，但血胰島素水平基本沒(méi)有變化(表1、2)。

2.2 綠茶提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的抑制作用

綠茶提取物具有較強(qiáng)的α-葡萄糖苷酶抑制活性，其IC50值為0.13g/L。綠茶提取物對(duì)α-淀粉酶也顯示出抑制活性，濃度為1g/L時(shí)，其抑制率為21％，抑制活性較弱。

2.3 綠茶提取物對(duì)兔小腸刷狀緣囊泡葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)活性的影響

響綠茶提取物劑量依賴性降低兔小腸刷狀緣囊泡的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)活性，其IC50值為3.5g/L。隨著濃度升高，兔小腸刷狀緣囊泡葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)活性降低幅度明顯減小，呈直角雙曲線關(guān)系。其對(duì)刷狀緣囊泡葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)的抑制作用為快速反應(yīng)。

3 討論

在糖尿病降糖藥物家族里α-葡萄糖苷酶抑制劑是一組通過(guò)延緩糖的消化和吸收來(lái)達(dá)到降低餐后血糖目的的口服降糖藥，其作用特點(diǎn)是在糖消化的最后一步抑制雙糖降解為單糖。α-淀粉酶抑制劑也能減慢食物淀粉在腸道中的消化，抑制餐后血糖水平的升高。因此兩者是近年來(lái)糖尿病口服藥物開(kāi)發(fā)研究的熱點(diǎn)。腸道對(duì)葡萄糖的吸收則以葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體的主動(dòng)吸收來(lái)完成，因此抑制葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)活性是降低餐后血糖的重要環(huán)節(jié)之一。本研究表明，綠茶提取物是α-葡萄糖苷酶的抑制劑，對(duì)α-淀粉酶也有一定抑制作用，同時(shí)降低兔小腸刷狀緣囊泡的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)活性，但沒(méi)能改變對(duì)本模型血胰島素水平。綠茶提取物具有降糖作用，主要表現(xiàn)為能降低糖尿病大鼠蔗糖或淀粉負(fù)荷后血糖的持續(xù)升高趨勢(shì)，從而改善其糖耐量。研究認(rèn)為這一作用可能與綠茶提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的抑制作用及葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)活性的抑制作用有關(guān)。

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