楊樹葉枯病是由半知菌亞門的鏈格孢菌(Al-ternariaalternata(Fr．)Keissl3引起的一種楊樹葉部病害，它既能危害插條苗，又會(huì)感染實(shí)生苗，發(fā)病最重者整株葉片全部枯死。該病從楊樹葉片抽生開始，危害楊樹葉片、嫩梢和幼莖，5-6月染病最重，受害的葉片會(huì)出現(xiàn)近圓形、多角形或不規(guī)則形的病斑，直徑可達(dá)1～5mm，病斑多時(shí)可連成大斑，病斑上有黑色霉?fàn)钗?，嫩梢和嫩莖上的病斑凹陷，呈菱形，上有綠色霉層。該病原菌寄生性不強(qiáng)，但寄主范圍很廣，常發(fā)生在農(nóng)作物、經(jīng)濟(jì)作物、果樹、蔬菜及雜草上，近年來又在用材林樹種及綠化樹種上發(fā)現(xiàn)，受害地區(qū)廣泛，主要集中在我國東北、西北、華北地區(qū)。而用材林上細(xì)鏈格孢菌，最早發(fā)現(xiàn)于一些楊樹雜交品種的葉部，形成大量的壞死型病斑，造成葉枯，提早落葉。楊樹葉枯病可危害毛白楊、小葉楊、小青楊、銀白楊、北京楊等多種楊樹，對(duì)楊樹苗木及幼林造成嚴(yán)重危害；如近幾年發(fā)生在北京市東北旺苗圃的毛白楊連年受此病的危害，1981年葉片感病率達(dá)100％，葉片大量提前脫落，四川省天全縣楊樹苗圃2000年感病率達(dá)85％以上，同時(shí)在黑龍江省也曾大面積發(fā)生，導(dǎo)致很多苗圃的苗木死亡，給林業(yè)生產(chǎn)造成了很大的經(jīng)濟(jì)損失，已成為影響當(dāng)?shù)貤顦鋬?yōu)質(zhì)高產(chǎn)的主要因素之一，找到治療之法已刻不容緩。

目前，由于化學(xué)殺菌劑對(duì)環(huán)境、人體帶來的副作用以及病原菌日益明顯的抗藥性，新的治療方法的出臺(tái)勢(shì)在必行，利用木霉菌作為生物殺菌劑的研究引起了世界各國的廣泛興趣。木霉菌(Trichoder-eelviride)是自然界中普遍存在并有豐富資源的拮抗微生物，常見于植物殘?bào)w及動(dòng)物糞便上，從植物的根圍及種子、球莖表面即可分離到，具有廣泛適應(yīng)性、產(chǎn)生拮抗物的多樣性、寄生的廣譜性和對(duì)環(huán)境影響小等特點(diǎn)，成為最有希望的生防因子。該菌是重要的植物真菌病原菌的抑制菌，具有較強(qiáng)的適應(yīng)性，通過營養(yǎng)爭奪、重寄生、產(chǎn)生抗性物質(zhì)或溶解酶類可以抑制許多病原菌，因此深入研究、開發(fā)和生產(chǎn)優(yōu)良木霉菌，對(duì)于防治植物真菌病害，促進(jìn)生產(chǎn)具有重要意義。在木霉菌的種群中有一大類被稱為拮抗(T.viride)。鉤狀木霉(T.hamatum)、長枝木霉(T.10ngibrachiatum)、康氏木霉(T．koningii)以及新近歸為粘帚霉屬的綠粘帚霉(Gliocladiumvirenstrichodermavirens)都屬于拮抗類，但目前農(nóng)業(yè)生防上商業(yè)化的產(chǎn)品主要是哈茨木霉菌株及少量的綠色木霉菌株，它們?cè)谥膊∩乐姓找媸艿街匾?，?yīng)用技術(shù)也不斷突破。多年來，人們對(duì)木霉菌的生防應(yīng)用、生物藥劑的開發(fā)以及生防機(jī)制做了很多嘗試和深入研究。國內(nèi)外許多學(xué)者將其用于防治水稻紋枯病，現(xiàn)在，木霉還可以用于葉面、花器和果實(shí)的保護(hù)：在葡萄園內(nèi)用綠色木霉的孢子液于始花期至收獲期噴施，可以降低灰霉引起的藤蔓腐爛以及果實(shí)在儲(chǔ)藏期的腐爛，有效地防治灰霉病。在楊樹爛皮病的生防研究中發(fā)現(xiàn)：木霉對(duì)爛皮病菌也有較好的防治效果，林間防治楊樹爛皮病治愈率達(dá)92.4％，預(yù)防效果達(dá)82.4％。茆振川報(bào)道了木霉菌對(duì)蘋果輪紋病的抑制作用，而且國外已有商品化的木霉制劑問世，如美國的Topshield(哈茨木霉T-22菌株)和以色列的Trichodez(哈茨木霉T39菌株)；同時(shí)在國內(nèi)，也已經(jīng)有關(guān)于其防治白涓病、猝倒病、灰霉病等的報(bào)道。木霉的拮抗機(jī)制也是多樣性的，一般有競爭作用、抗生作用、重寄生作用等。據(jù)不完全資料統(tǒng)計(jì)，木霉至少對(duì)18個(gè)屬29種病原真菌在體外或體內(nèi)表現(xiàn)有拮抗作用。目前葉枯病的防治，在很大程度上還是依賴于化學(xué)防治，一般從發(fā)病開始在整個(gè)生長季節(jié)噴灑2～3次的40％的乙膦鋁300倍液，或75％百菌清500倍液，或50％的多菌靈l000倍液防治，并通過及時(shí)清理枯枝落葉帶出林外集中燒毀或埋漚制肥的方法減少病源，從而減少發(fā)病率。利用化學(xué)方法防治楊樹葉枯病時(shí)，化學(xué)藥物在抑制病原菌的同時(shí)也將殺死樹體上有益的拈抗微生物，同時(shí)也會(huì)使病原菌產(chǎn)生抗藥性并污染環(huán)境。在可持續(xù)發(fā)展呼聲越來越高的今天，化學(xué)公害越來越嚴(yán)重，木霉作為一類資源豐富的拮抗微生物，在植物病害生物防治中扮演著越來越重要的角色；同時(shí)，隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的不斷發(fā)展，木霉的生防效果和穩(wěn)定性有了顯著的提高，并展示出廣闊的應(yīng)用前景；這些為木霉菌對(duì)楊樹葉枯病的抑制作用提出了可能。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)菌種

病原菌：病株取樣楊葉枯病病菌

生防菌：綠色木霉、哈茨木霉

1.1.2 培養(yǎng)基的制備

1.2 培養(yǎng)基的制備

試驗(yàn)所用培養(yǎng)基均采用PDA培養(yǎng)基。

配方：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，硫酸鎂1.5g，磷酸二氫鈉3g，瓊脂20g，水1000mL；

將洗凈后帶皮的馬鈴薯切碎，加入定量的水煮沸30min，用紗布濾出馬鈴薯殘?jiān)尤氕傊?，加熱使瓊脂完全融化，再加入糖，并補(bǔ)入適量的水，使最后的總量仍然為原量。分裝在試管和三角瓶中，然后滅菌備用。

1.2 病原菌的鑒別

1.2.1 癥狀觀察

選取具有典型楊樹葉枯病癥狀的楊樹葉片觀察，其癥狀如下：初期，感病葉片上產(chǎn)生隱約可見的褐色斑，以后病斑逐漸擴(kuò)大。病斑黃色，中央褐色。后期，病斑上產(chǎn)生黑褐色霉?fàn)钗?，為病原菌的分生孢子梗和分生孢子。病斑可相互連成大斑，全葉枯死。

1.2.2 病原茵觀察及鑒定

選取具有典型癥狀的楊樹葉片病部，進(jìn)行鏡檢。直接用針挑取少許菌絲體，放在加有水滴的載玻片上，加蓋玻片后在顯微鏡下鏡檢。

1.3 病原菌的分離和純化

1.3.1 楊樹葉枯病病原茵的分離

選擇新發(fā)病的植株器官或組織作為分理材料然后進(jìn)行組織表面消毒，消毒時(shí)先用70％酒精浸泡病組織2～3S，趕走病組織表面氣泡，然后用次氯酸鈉消毒，消毒后用滅菌水沖洗2～3次。

次氯酸鈉消毒液配方30％(現(xiàn)配現(xiàn)用)：次氯酸鈉(NaCl0₃)，30g；水，100mL。

取楊樹葉枯病的病葉，直接用移植鉤挑取菌株的菌絲，接種于PDA平板中央，于25℃恒溫箱中培養(yǎng)3d。3d之后，觀察各菌落形態(tài)，直接用針挑取少許的菌組織放在加有水滴的載玻片上，加蓋玻片后在顯微鏡下檢視，根據(jù)菌落形態(tài)，確定病原菌。

1.3.2 楊樹葉枯病病原茵的純化

采用微塊單孢分離法，挑取供純化菌種的孢子少許加于試管內(nèi)的無菌水中，搖動(dòng)混合1～2min使孢子充分散開。調(diào)節(jié)孢子濃度到10倍視野中2～5個(gè)孢子。取此孢子懸浮液2～3mL倒入4％水洋菜平板表面，輕輕左右搖動(dòng)培養(yǎng)皿使孢子液均勻展布于培養(yǎng)基表面靜置5min，使大部分孢子沉淀，然后傾斜培養(yǎng)皿，用吸管吸去多余的孢子液。用滅菌刀將帶有分散孢子的水洋菜平板切成0.3cm×0.3cm小塊，移至載玻片上檢查。逐個(gè)檢查，見有單個(gè)孢子的微塊，隨即用移植鏟移入PDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每皿可放4～5塊。

1.4 試驗(yàn)方法

在直徑9cm培養(yǎng)皿的PDA平板培養(yǎng)基上，相距3CiTi分別接入直徑0.6cm培養(yǎng)5d的近乎同質(zhì)、等量的楊樹葉枯病病原真菌和木霉菌(Trichoder-maspp．)。對(duì)照則在平板中心各接入直徑0.6cm的楊葉枯病病原菌和木霉菌(Trichodermaspp．)。每個(gè)處理設(shè)置5個(gè)重復(fù)，置于生化培養(yǎng)箱中，用散射光、25℃培養(yǎng)。每12h測(cè)量菌落的半徑，連續(xù)觀察3d。

拮抗結(jié)果計(jì)算時(shí)，采用兩菌落相向半徑進(jìn)行拮抗生長測(cè)定。

由于拮抗真菌抑制病原真菌的同時(shí)，其本身也被病原真菌所抑制，因此在計(jì)算拮抗效果時(shí)，采用相對(duì)抑菌效果，即拮抗真菌被抑制1％個(gè)單位所產(chǎn)生的效果。被抑制率與相對(duì)抑菌效果的計(jì)算m1如下：

被抑制率-[(單獨(dú)培養(yǎng)菌落半徑)-(菌落趨向半徑)]／(單獨(dú)培養(yǎng)菌落半徑)×100％；

相對(duì)抑菌效果=病原菌被抑制率／拮抗菌被抑制率。

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