2結(jié)果與分析

2.1樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.1.1提取溶劑的選擇和提取次數(shù)的優(yōu)化

本次實(shí)驗(yàn)樣品為糕點(diǎn)，因添加劑的極性不同，采用液液提取方式便能將不同極性的添加劑提取出來。實(shí)驗(yàn)對(duì)比了30%、40%、50%、60%、70%、80%乙腈水溶液，30%、40%、50%、60%、70%、80%甲醇水溶液對(duì)添加劑的提取效果，在同一批次的糕點(diǎn)樣品中加入質(zhì)量濃度為100ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，提取結(jié)果如圖1所示，大多數(shù)化合物在乙腈水溶液作為提取液時(shí)提取效率較高，隨著乙腈濃度的增高，提取效率也增高，當(dāng)乙腈濃度達(dá)到50%時(shí)，提取效率達(dá)到穩(wěn)定；而在70%甲醇水溶液的時(shí)候，提取效率是最高的，由圖1可知，在50%乙腈水溶液或70%甲醇水溶液時(shí)提取效率幾乎相同，但考慮到本實(shí)驗(yàn)的樣品是糕點(diǎn)，有機(jī)溶劑濃度越大，則蛋白沉淀越完全，提取的上清液則越澄清，無絮狀物漂浮在上清液中，故選擇70%甲醇水溶液作為化合物的提取液。為了確保目標(biāo)化合物的提取回收率，本實(shí)驗(yàn)對(duì)70%甲醇水的提取次數(shù)進(jìn)行比較，在糕點(diǎn)中加入100ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液后超聲提取1、2、3次，將每次提取完后上清液都定容上機(jī)測(cè)定。結(jié)果表明，兩次提取的回收率在80.6%～113.5%之間，滿足實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)要求。為盡量減少前處理的繁瑣，及目標(biāo)化合物的損失，因此，本實(shí)驗(yàn)的提取次數(shù)選擇兩次。

2.1.2提取時(shí)間的優(yōu)化

準(zhǔn)確稱量7份糕點(diǎn)樣品1.00g（精確到0.01g），置于50mL離心管中，分別加入質(zhì)量濃度為100ng/mL的混標(biāo)溶液，加入10mL70%甲醇，渦旋后在超聲下分別提取5、10、20、30min，超聲提取，隨著超聲提取時(shí)間的增長，提取效率增加，當(dāng)超聲提取時(shí)間到10min時(shí)，31種添加劑的色譜峰面積響應(yīng)值基本達(dá)到穩(wěn)定，為盡量減少前處理的時(shí)間，因此，本實(shí)驗(yàn)的超聲提取時(shí)間選擇10min。

2.1.3固相萃取柱的考察

糕點(diǎn)樣品基質(zhì)化學(xué)成分復(fù)雜，一般含有的物質(zhì)有糖、脂肪、蛋白質(zhì)等，其脂肪的存在影響目標(biāo)物的提取與凈化，在測(cè)定時(shí)易產(chǎn)生離子抑制效應(yīng)，本研究考察了以下6種樣品凈化方法：（1）HLB固相萃取柱凈化，甲醇洗脫；（2）PRIMEHLB固相萃取柱凈化，乙腈∶甲醇=90∶10洗脫；（3）MCX固相萃取柱凈化，5%氨水甲醇洗脫；（4）WAX固相萃取柱凈化，5%氨水甲醇洗脫；（5）MAX固相萃取柱凈化，2%甲酸的甲醇洗脫；（6）WCX固相萃取柱凈化，2%甲酸的甲醇洗脫。

在考察不同固相萃取柱時(shí)，配制400ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（5%甲醇作為溶劑），取5mL分別注入已經(jīng)預(yù)處理好的固相萃取柱，并按照以上6種凈化方法進(jìn)行洗脫，各種固相萃取柱對(duì)31種目標(biāo)化合物的回收率見表3。

HLB固相萃取柱的填料由水浸潤性的共聚物構(gòu)成，其結(jié)構(gòu)中同時(shí)具有親水單體和親脂單體，對(duì)于極性化合物和非極性化合物都有很好的保留，無需經(jīng)過活化和平衡就能有效地吸附各種化合物，是一種優(yōu)良的可用于酸、堿和中性化合物的親水-親脂平衡反相吸附劑；PRIMEHLB固相萃取柱則能更好的去除樣品中的磷脂，延長液相色譜柱的使用壽命并避免質(zhì)譜儀發(fā)生離子抑制和污染；MCX、MAX固相萃取柱的填料分別屬于用于分析堿類化合物的混合模式陽離子交換吸附劑和分析酸類化合物的混合模式陰離子交換吸附劑；WCX、WAX固相萃取柱的填料則分別屬于分析強(qiáng)堿和季胺類化合物的混合模式弱陽離子交換吸附劑、分析強(qiáng)酸化合物的混合模式弱陰離子交換吸附劑。其中MCX、MAX、WCX、WAX四種固相萃取柱適用的化合物范圍都各有側(cè)重，HLB固相萃取柱適合的化合物的pH最廣，50%以上的目標(biāo)化合物回收率滿足實(shí)驗(yàn)要求，由于31種目標(biāo)化合物中大部分是酸性化合物，其pH小于6，經(jīng)過WAX固相萃取柱凈化后，90%以上的化合物都能達(dá)到70%的回收率，基本滿足實(shí)驗(yàn)要求，最后選擇WAX固相萃取柱進(jìn)行凈化。

2.2色譜條件的優(yōu)化

2.2.1色譜柱的考察

本實(shí)驗(yàn)對(duì)31種添加劑的進(jìn)行分離，對(duì)色譜柱的分離效果要求較高。本實(shí)驗(yàn)考察了3種規(guī)格的C₁₈色譜柱，包括KinetexC₁₈色譜柱（2.6μm，2.1×100mm），UltimateXB-C₁₈色譜柱（3μm，2.1×100mm）和AtlantisT₃色譜柱（3μm，2.1×150mm）。KinetexC₁₈色譜柱對(duì)結(jié)構(gòu)相似的胭脂紅、喹啉黃和檸檬黃3種著色劑保留較差，而UltimateXB-C₁₈色譜柱則對(duì)著色劑實(shí)現(xiàn)較好的分離，但并不能實(shí)現(xiàn)對(duì)防腐劑和甜味劑的分離。色譜柱AtlantisT3能使31種添加劑在11min內(nèi)實(shí)現(xiàn)色譜保留和基線分離。

2.2.2質(zhì)譜條件的優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)進(jìn)樣方式為流動(dòng)注射泵直接進(jìn)樣，分別對(duì)31種添加劑的標(biāo)準(zhǔn)溶液（2μg/mL）進(jìn)行進(jìn)樣分析。在全掃描模式（Q₁MS）下，選擇響應(yīng)高，同時(shí)接近目標(biāo)物分子電離方式的母離子，并比較母離子在正、負(fù)離子模式下的響應(yīng)情況，最終選取m/z響應(yīng)值最高的作為定量離子。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，山梨酸、苯甲酸等26種添加劑在負(fù)離子電離模式下響應(yīng)值較高，而羅丹明B、堿性橙2等5種添加劑在正離子電離模式下響應(yīng)值較高。在對(duì)應(yīng)的電離方式下，優(yōu)化母離子的去簇電壓（DP），同時(shí)在子離子模式[productIon（MS₂）]下選擇兩個(gè)響應(yīng)值較高的子離子，在多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式下，對(duì)不同化合物的碰撞能量進(jìn)行優(yōu)化。

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