（2）不同提取溶劑下的凈化方式考察

苯甲酸在酸性下pH2.5～4.0時(shí)，抑菌活性最強(qiáng)，不溶于水，在堿性條件下，溶于水，在食品中添加苯甲酸鈉時(shí)，若食品為酸性食品，苯甲酸鈉會(huì)轉(zhuǎn)變成苯甲酸；山梨酸在乙醇中易溶，在水中極微溶解，酸性下，不溶于水，在堿性條件下，溶于水，在糕點(diǎn)中使用時(shí)，可加入山梨酸，也可以加入山梨酸鉀；糖精鈉易溶于水(1g/1.5mL)，微溶于乙醇(1g/50mL)，耐弱堿性；脫氫乙酸難溶于水，溶于苯、乙醚、丙酮及熱乙醇中，但在堿性條件下，溶于水，根據(jù)這4組分的性質(zhì)，本次試驗(yàn)沒(méi)有同時(shí)含有4組分的陽(yáng)性樣品，選擇了陰性樣品(糕點(diǎn))進(jìn)行加標(biāo)試驗(yàn)，考察了水、1％乙醇(1％氨水)、5％乙醇(1％氨水)、1％氨水、5％甲醇(1％氨水)、10％甲醇(1％氨水)、水-乙酸鋅-氫氧化鈉7種提取溶劑對(duì)4組分峰的影響，稱取糕點(diǎn)樣品14份，每種提取溶劑平行2份，精密加入混合標(biāo)準(zhǔn)使用液2.0mL，按樣品(無(wú)奶油蛋糕或面包、辣條、月餅)2g于50mL具塞離心管中，加5％乙醇(含1％氨水)提取，50℃超聲20min，冷卻至室溫，加219g/L亞鐵氰化鉀、106g/L乙酸鋅溶液各2mL，渦旋混勻，于10000r/min離心5min，上清液轉(zhuǎn)移至50mL容量瓶，殘?jiān)偬崛∫淮?，合?次濾液，定容至刻度。

取15mL提取液，加10mL正己烷，渦旋5min，離心后，吸取下層過(guò)濾上機(jī)分析，制備供試品溶液，上機(jī)測(cè)定，得到色譜圖，從圖中可以看出水-乙酸鋅-氫氧化鈉作為提取溶劑，存在峰拖尾現(xiàn)象，而且考慮到后期方法學(xué)以及高加入量回收樣品導(dǎo)致的色譜峰分離度達(dá)不到要求，故不考慮5％甲醇(含1％氨水)、10％甲醇(含1％氨水)；對(duì)于含油脂比較大的辣條類糕點(diǎn)，采用水作為提取溶劑，提取效率不明顯，故也不考慮水作為提取溶劑。

因此，提取溶劑為1％乙醇(1％氨水)、5％乙醇(1％氨水)、1％氨水，為進(jìn)一步確定提取溶劑，本試驗(yàn)對(duì)這3種提取溶劑進(jìn)行加標(biāo)含量測(cè)定，稱取糕點(diǎn)、月餅、辣條3類樣品各3份，精密加入混合標(biāo)準(zhǔn)使用液2.0mL，樣品(無(wú)奶油蛋糕或面包、辣條、月餅)2g于50mL具塞離心管中，加5％乙醇(含1％氨水)提取，50℃超聲20min，冷卻至室溫，加219g/L亞鐵氰化鉀、106g/L乙酸鋅溶液各2mL，渦旋混勻，于10000r/min離心5min，上清液轉(zhuǎn)移至50mL容量瓶，殘?jiān)偬崛∫淮?，合?次濾液，定容至刻度。

取15mL提取液，加10mL正己烷，渦旋5min，離心后，吸取下層過(guò)濾上機(jī)分析。按上述制備供試品溶液，上機(jī)測(cè)定，外標(biāo)法定量計(jì)算各組分含量，從表中可知，對(duì)于分類為糕點(diǎn)的樣品，無(wú)論是糕點(diǎn)、月餅還是辣條，當(dāng)提取溶劑呈偏堿性時(shí)，提取率更高，特別是油脂含量高的樣品，偏堿性的環(huán)境更好的保護(hù)這4種目標(biāo)物的損失，故提取溶劑在5％乙醇(1％氨水)時(shí)，樣品所得4組分含量都是最高的，綜合考慮，提取溶劑選擇為5％乙醇(1％氨水)。

將篩選出來(lái)的堿性提取溶劑測(cè)定pH值，分別為：1％乙醇(1％氨水)pH為9.01～9.15；5％乙醇(含1％氨水)pH為9.04～9.15；1％氨水pH為9.25～9.40。然后用正己烷進(jìn)行提取，稱取糕點(diǎn)樣品，經(jīng)過(guò)加標(biāo)，混合標(biāo)準(zhǔn)使用液3.00mL，理論加標(biāo)量150mg/kg，試驗(yàn)上機(jī)測(cè)定，得到4組分含量結(jié)果見(jiàn)表4。

從結(jié)果中可見(jiàn)，當(dāng)提取液pH呈酸性時(shí)，HLB對(duì)目標(biāo)組分有保留，當(dāng)呈堿性時(shí)，對(duì)目標(biāo)組分保留較低，正己烷萃取1次導(dǎo)致的目標(biāo)物損失也降低，若萃取2次會(huì)使糖精鈉與脫氫乙酸的峰更加接近，可能導(dǎo)致分離度達(dá)不到要求，且目標(biāo)物會(huì)有損失，故去除提取液中油脂需在堿性條件下進(jìn)行。

5、方法學(xué)的考察

（1）線性關(guān)系考察

分別精密量取苯甲酸對(duì)照品51.28mg置25mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為2.0471mg/mL的苯甲酸儲(chǔ)備液；稱取山梨酸對(duì)照品51.88mg置25mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為2.0690mg/mL的山梨酸儲(chǔ)備液；稱取糖精鈉對(duì)照品55.10mg置25mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為1.9007mg/mL的糖精鈉儲(chǔ)備液，糖精鈉相對(duì)分子質(zhì)量為205.16，糖精相對(duì)分子質(zhì)量為182.16，兩者折算系數(shù)為0.8874，故折算為糖精濃度為1.6867mg/mL；稱取脫氫乙酸對(duì)照品51.71mg置25mL量瓶中，加20g/L氫氧化鈉4mL溶解，用水定容至刻度，即得濃度為2.0477mg/mL的脫氫乙酸儲(chǔ)備液，對(duì)照品儲(chǔ)備液5.0mL至100mL容量瓶中，以水定容的混合標(biāo)準(zhǔn)使用液0.00mL、0.1mL、0.5mL、1.0mL、2.0mL、3.0mL，分別至10mL容量瓶中，加水稀釋并定容至刻度，搖勻，即得到標(biāo)準(zhǔn)線性。

按上述色譜條件進(jìn)行上機(jī)測(cè)試，以峰面積為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)線性，得到線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)，采用信噪比法評(píng)估檢測(cè)限，利用已知低濃度的分析物樣品與空白樣品的測(cè)量信號(hào)進(jìn)行比較，確定能夠可靠檢出的最小的濃度，典型的可接受的檢出限信噪比是2:1或3:1，結(jié)果見(jiàn)表5，圖3，4組分線性關(guān)系良好，濃度范圍覆蓋1個(gè)數(shù)量級(jí)，相關(guān)系數(shù)均大于0.999，濃度范圍覆蓋了GB2760中要求的限量值(糕點(diǎn)類1.09/kg)滿足食品檢測(cè)要求。表5結(jié)果表明，各基質(zhì)在本試驗(yàn)方法下檢測(cè)限達(dá)到檢測(cè)要求，且比國(guó)標(biāo)GB5009.28和SG5009.121要低。

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