2基于“五原則”的鹿茸Q-Marker辨識分析

Q-Marker由劉昌孝院士于2016年創(chuàng)新性地提出，即中藥材和中藥產(chǎn)品中固有的或加工制備過程中形成的、與中藥功能屬性密切相關(guān)的化學(xué)物質(zhì)，能反映中藥安全性和有效性的標(biāo)示性物質(zhì)。Q-Marker需同時(shí)滿足中醫(yī)藥理論相關(guān)性、特有性、有效性、可測性和傳遞與溯源性5大基本原則。基于“五原則”的Q-Marker辨識分析對鹿茸Q-Marker的篩選具有重要意義。

2.1鹿茸中Q-Marker的有效性

有效性是Q-Marker的核心要素，有效性主要體現(xiàn)在藥性、藥效和入血成分及其代謝產(chǎn)物等。鹿茸始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，位列中品，謂：“鹿茸味甘，性溫……主漏下惡血，寒熱驚癇，益智強(qiáng)智，生齒不老”，歷代本草及藥典中均有收載。《中國藥典》2020年版鹿茸項(xiàng)下描述包括“味甘、咸；歸腎、肝經(jīng)；具有壯腎陽，益精血，強(qiáng)筋骨，調(diào)沖任，托瘡毒的功效，主治腎陽不足，精血虧損，陽痿滑精，宮冷不孕，羸瘦，神疲，畏寒，眩暈，耳鳴，耳聾，腰脊冷痛，筋骨痿軟，崩漏帶下，陰疽不斂”。

通過對古籍及《中國藥典》的考察不難發(fā)現(xiàn)，藥性方面，鹿茸性溫，具有補(bǔ)腎壯陽之功效，鹿茸可以通過興奮下丘腦-垂體-性腺內(nèi)分泌軸使血液中性激素含量升高。味甘、咸，甘味系其中豐富的多糖、氨基酸等成分，與調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力、抗骨質(zhì)疏松等藥理功能密切相關(guān)；咸味系其中的礦質(zhì)元素，具有抗菌、抗炎等功效。歸腎、肝經(jīng)，具有壯腎陽功效的鹿茸入腎經(jīng)，符合中醫(yī)認(rèn)為腎主生殖的理論。藥效方面，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，鹿茸具有抗骨質(zhì)疏松、抗衰老、抗氧化、抗疲勞、抗腫瘤、抗抑郁、抗肝損傷、增強(qiáng)記憶力、提高機(jī)體免疫力及性激素樣作用等多種藥理活性。呂經(jīng)緯等通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究獲得了鹿茸中的17β-雌二醇、氨基葡萄糖、雌酮、D-葡萄糖醛酸等14個(gè)成分及306個(gè)靶點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)了甲狀腺受體相互作用蛋白2、腺苷酸環(huán)化酶1型等26個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白，進(jìn)一步揭示了鹿茸在治療骨質(zhì)疏松和抗腫瘤方面具有潛在的優(yōu)勢。

然而，鹿茸中入血成分及其代謝產(chǎn)物的研究相對較少，Yu等通過體外模擬鹿茸胃腸道消化反應(yīng)，采用LC-MS/MS鑒定分析了鹿茸水提物、胃液消化物和胰液消化物中23、387、417個(gè)肽段，研究表明膠原蛋白是鹿茸中的主要蛋白質(zhì)，在胃消化物中釋放了34種多肽，在胰消化物中釋放了146種多肽。關(guān)于鹿茸中入血成分及其代謝產(chǎn)物的研究有待進(jìn)一步加強(qiáng)。

2.2鹿茸中Q-Marker與中醫(yī)藥理論的相關(guān)性

中藥配伍是中醫(yī)藥理論的核心內(nèi)容，中藥配伍后能顯著影響藥效物質(zhì)基礎(chǔ)與作用機(jī)制，同一藥材在不同處方中以“君、臣、佐、使”發(fā)揮不同的藥效。Q-Marker的篩選要求延伸到臨床應(yīng)用層面，應(yīng)基于中藥臨床應(yīng)用最終效應(yīng)成分及其功效的臨床表達(dá)形式確定Q-Marker。林賀等系統(tǒng)整理了自漢至清的中醫(yī)藥典籍發(fā)現(xiàn)，中醫(yī)藥古籍和傳統(tǒng)方劑中含鹿茸的方劑包括800余首，充分扮演了“君、臣、佐、使”的角色，鹿茸用量在1分～2斤8兩，大部分用量在2錢～4兩，用法上常與肉蓯蓉、菟絲子、附子、當(dāng)歸、牛膝、人參、五味子等配伍使用，發(fā)揮壯腎陽、益精血、強(qiáng)筋骨之功效。

鑒于中藥方劑“君、臣、佐、使”的配伍原則，鹿茸中Q-Marker的篩選需充分考慮其配伍環(huán)境，一方面應(yīng)與鹿茸“壯腎陽、益精血、強(qiáng)筋骨”的臨床療效密切相關(guān)，另一方面鹿茸中的Q-Marker含量應(yīng)相對較高，避免其在復(fù)方中用量較低時(shí)難于檢測。

2.3鹿茸中Q-Marker的特有性

特有性是中藥鑒別、質(zhì)量控制和評價(jià)的核心，具有專屬性，主要體現(xiàn)在2個(gè)層次：（1）能代表和反映同一類藥材的共有性并區(qū)別于其他藥材的特征性成分；（2）能反映同一類、不同種藥材之間的差異性成分。鹿茸Q-Marker特有性的內(nèi)涵包含系統(tǒng)演化、親緣關(guān)系學(xué)、生物學(xué)特性和特異性成分等，又與道地產(chǎn)區(qū)，不同形態(tài)、生長階段和產(chǎn)地初加工方式等密切相關(guān)。

2.3.1鹿茸的共性及區(qū)分于其他物種的特異性

(1）基于系統(tǒng)演化和親緣關(guān)系學(xué)分析的鹿茸Q-Marker篩選：《中國藥典》2020年版一部中明確規(guī)定鹿茸基原為鹿科動(dòng)物梅花鹿和馬鹿雄鹿未骨化密生絨毛的幼角，但目前市場上鹿茸基原混雜，大量偽品充斥市場，主要包括赤鹿茸、馴鹿茸和駝鹿茸。由于遺傳物質(zhì)的差異，不同物種形態(tài)及化學(xué)成分均會表現(xiàn)出差異，最終影響中藥的療效。

現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展為鹿科動(dòng)物系統(tǒng)演化和親緣關(guān)系分析提供了可靠的技術(shù)手段，鞠妍等以線粒體DNA序列差異為依據(jù)分析了鹿科動(dòng)物的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系（圖1），研究表明以線粒體DNA為依據(jù)能將梅花鹿、馬鹿、馴鹿、駝鹿等20多種鹿科動(dòng)物系統(tǒng)分為鹿亞科、麂亞科、空齒鹿亞科和獐亞科，其中梅花鹿和馬鹿為親緣關(guān)系最近的姐妹群，并能與馴鹿、駝鹿等明顯區(qū)分開。賈靜等以DNA條形碼對71份市售鹿茸粉藥材進(jìn)行鑒定，其中38%為《中國藥典》2020年版規(guī)定的基原，62%為其他基原，以馴鹿為主。

截止目前，《中國藥典》2020年版中采用PCR法進(jìn)行基原鑒別的藥材包括蘄蛇、烏梢蛇和川貝母，應(yīng)用DNA分子鑒別中藥基原得到了業(yè)界廣泛的認(rèn)可，《中國藥典》中將PCR法應(yīng)用于中藥基原的鑒別有逐漸增加的趨勢。以分子生物學(xué)技術(shù)篩選梅花鹿、馬鹿中的特異性DNA片段構(gòu)建鹿茸基原的鑒別方法具有較好的應(yīng)用前景。

此外，在物種遺傳物質(zhì)不同的基礎(chǔ)上，其調(diào)控體內(nèi)所表達(dá)的蛋白質(zhì)等具有高度特異性。《中國藥典》2020年版采用液質(zhì)聯(lián)用的方法分析阿膠、龜甲膠和鹿角膠中特異性肽段，進(jìn)而控制中藥基原。中國食品藥品檢定研究院最新的研究表明，梅花鹿茸、馬鹿茸和馴鹿茸中有明顯的特異性多肽，可以通過主成分和偏最小二乘法等分析方法進(jìn)一步篩選、鑒別。

(2）生物學(xué)特性結(jié)合化學(xué)成分分析的鹿茸Q-Marker篩選：藥用植物能夠在體內(nèi)通過乙酸-丙二酸途徑、甲戊二羥酸途徑、莽草酸途徑、氨基酸途徑及其復(fù)合途徑等生源途徑代謝產(chǎn)生苯丙素類、醌類、黃酮類、萜類和生物堿類等成千上萬的次生代謝產(chǎn)物，其在植物中的生成和分布通常具有種屬、組織器官和生長發(fā)育期的特異性。對藥用植物次生代謝產(chǎn)物及其生源途徑特異性分析有助于Q-Marker的篩選。然而，動(dòng)物藥中通常無特異性次生代謝產(chǎn)物，次生代謝產(chǎn)物代謝路徑研究少且不深入導(dǎo)致動(dòng)物藥中Q-Marker的篩選較為困難。但鹿茸因其由軟骨組織發(fā)育且具有周期性脫落等獨(dú)特的生物學(xué)特性（圖2），為鹿茸中Q-Marker的篩選提供了較好的切入點(diǎn)。

首先，鹿茸為典型的動(dòng)物藥，膠原蛋白是動(dòng)物異于植物的重要結(jié)構(gòu)蛋白，主要存在于動(dòng)物結(jié)締組織（皮膚、肌肉）、骨骼、軟骨等，具有促進(jìn)傷口愈合、潤滑關(guān)節(jié)等功能。其中羥脯氨酸是構(gòu)成膠原蛋白的特異性氨基酸，不參與其他蛋白質(zhì)的合成，系膠原蛋白合成過程中已合成肽鏈中的脯氨酸被羥化酶轉(zhuǎn)化而成?！吨袊幍洹?020年版采用異硫氰酸苯酯柱前衍生HPLC法對阿膠、龜甲膠和鹿角膠中羥脯氨酸進(jìn)行含量測定，并對3種膠類中藥中羥脯氨酸含量提出限量標(biāo)準(zhǔn)。本課題組采用氨基酸自動(dòng)分析儀對鹿茸中羥脯氨酸進(jìn)行含量測定發(fā)現(xiàn)，梅花鹿茸和馬鹿茸中均能檢出羥脯氨酸且含量差異不顯著，不同加工和炮制方式鹿茸中羥脯氨酸含量最低為2.49%。

其次，鹿茸不同于其他動(dòng)物藥，系軟骨組織發(fā)育而來，硫酸軟骨素是高等動(dòng)物軟骨組織中特有的酸性黏多糖，具有抗關(guān)節(jié)炎、抗骨質(zhì)疏松和抗腫瘤等生物學(xué)活性，能夠部分代表鹿茸的臨床療效，是鹿茸中相對特異的化學(xué)成分。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，鹿茸中硫酸軟骨素存在形式以硫酸軟骨素A、B和C為主，梅花鹿茸和馬鹿茸中均能檢出硫酸軟骨素且含量差異不顯著，不同部位和規(guī)格鹿茸中硫酸軟骨素含量存在顯著差異，鹿茸中硫酸軟骨素質(zhì)量分?jǐn)?shù)最低為960 mg/kg，鹿角僅為410mg/kg。呂經(jīng)緯等通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，鹿茸中硫酸軟骨素的重要組成單元氨基葡萄糖能夠協(xié)同其他多個(gè)化學(xué)成分通過腺苷酸環(huán)化酶1型等10個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)作用于癌癥信號通路，提示氨基葡萄糖具有抗腫瘤和增強(qiáng)免疫力的作用。因此，以生物學(xué)特性、化學(xué)成分特異性、藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和藥理作用為考量因素，硫酸軟骨素是鹿茸中Q-Marker的不錯(cuò)選擇。

此外，鹿茸是迄今為止發(fā)現(xiàn)的哺乳動(dòng)物中唯一可再生的器官，其中含有豐富的血管、神經(jīng)等組織，γ-氨基丁酸是一種非蛋白組成氨基酸，在哺乳動(dòng)物中僅存在于神經(jīng)組織中，具有抗疲勞、促睡眠等作用。\本課題組對鹿茸、鹿角、鹿角霜及鹿角膠等鹿制品中γ-氨基丁酸進(jìn)行含量測定發(fā)現(xiàn)，梅花鹿茸和馬鹿茸中均能檢出γ-氨基丁酸，且含量差異不顯著，鹿茸中γ-氨基丁酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)最低為350 mg/kg，鹿角中γ-氨基丁酸顯著低于鹿茸，為130 mg/kg，鹿角霜中幾乎不含γ-氨基丁酸。γ-氨基丁酸廣泛存在于植物、動(dòng)物及微生物中，作為鹿茸中Q-Marker特異性較差，但可以考慮以γ-氨基丁酸含量為輔結(jié)合其他化學(xué)成分綜合評價(jià)鹿茸質(zhì)量。

最后，鹿茸奇特的生物學(xué)特性還包括周期性的脫落與再生，鹿茸在春季萌生，初秋長成后褪去茸皮變成鹿角，用于交配中競爭配偶，鹿角于冬季或早春脫落?，F(xiàn)代研究表明，鹿茸的生長和再生與動(dòng)物體內(nèi)性激素水平密切相關(guān)，孕酮和雄激素相互拮抗調(diào)節(jié)鹿茸的發(fā)生、生長、骨化和脫落。激素的生理功能也與鹿茸“補(bǔ)腎陽，調(diào)沖任”的功效密切相關(guān)。李春燕等建立了鹿茸中18種性激素的提取技術(shù)。Lu等采用GC-MS法測定了不同產(chǎn)地鹿茸中18種激素含量，發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)區(qū)及部位鹿茸中性激素含量差異顯著。激素作為鹿茸中Q-Marker具有一定的特異性，但因激素具有微量、高效的特點(diǎn)，其在鹿茸及鹿制品中含量低且難于檢測，鹿茸以貴細(xì)藥材在中藥復(fù)方中少量使用時(shí)更加難于檢測。

綜上所述，基于系統(tǒng)演化和親緣關(guān)系學(xué)分析的DNA及特異性肽段為鹿茸基原真?zhèn)蔚蔫b別提供了保障，生物學(xué)特性結(jié)合化學(xué)成分分析的羥脯氨酸、硫酸軟骨素、γ-氨基丁酸和激素等多指標(biāo)相結(jié)合的Q-Marker為鹿茸質(zhì)量控制提供了新的思路。

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