2.4　菌齡對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)量與再生率的影響

試驗(yàn)結(jié)果如圖3，當(dāng)菌齡低于4天，隨著菌齡的增加，原生質(zhì)體的產(chǎn)量也會(huì)增加，當(dāng)菌齡高于4天時(shí)，隨著菌齡的增加，原生質(zhì)體的再生率逐步降低；當(dāng)菌齡大于6天時(shí)，原生質(zhì)體再生率急速下降。經(jīng)過(guò)回歸方程計(jì)算可以得出：原生質(zhì)體再生率在5.4天時(shí)達(dá)到最高，約為2.07%；原生質(zhì)體的產(chǎn)量在4.1天時(shí)達(dá)到頂點(diǎn)，為2.01×108個(gè)/毫升。

2.5　穩(wěn)滲劑種類對(duì)原生質(zhì)體制備產(chǎn)量與再生率的影響

圖4可以看出，當(dāng)選取甘露醇作為滲穩(wěn)劑時(shí)，原生質(zhì)體的產(chǎn)量最高但是再生率很低，當(dāng)使用硫酸鎂作為穩(wěn)滲劑時(shí)，原生質(zhì)體的產(chǎn)量排名第三，僅處于甘露醇和葡萄糖作為滲穩(wěn)劑之后；硫酸鎂的再生率為1.73%，葡萄糖的再生率為1.60%，此再生率僅次于用蔗糖當(dāng)作穩(wěn)滲劑的再生平板，蔗糖的再生率為1.94%。由于在制備原生質(zhì)體時(shí)，使用硫酸鎂當(dāng)作穩(wěn)滲劑，不但能夠較好的維持菌絲體細(xì)胞膜內(nèi)外滲透壓的穩(wěn)定性，同時(shí)滲穩(wěn)劑中的Mg2+也能夠通過(guò)交聯(lián)羧基和磷脂質(zhì)實(shí)現(xiàn)維持細(xì)胞膜穩(wěn)定的作用。但是Mg2+的供能能力較差，難以維持細(xì)胞壁再生所需要的能量，同理單糖也無(wú)法實(shí)現(xiàn)此項(xiàng)需求。因此，想要實(shí)現(xiàn)原生質(zhì)體再生率最大化，應(yīng)該選用硫酸鎂作為制備滲穩(wěn)劑，蔗糖作為再生滲穩(wěn)劑。

2.6　穩(wěn)滲劑濃度對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)量與再生率的影響

圖5可以看出，滲穩(wěn)劑濃度對(duì)于原生質(zhì)體的產(chǎn)量和再生率都能產(chǎn)生影響，當(dāng)使用純凈水作為參照時(shí)，目標(biāo)菌絲的原生質(zhì)體產(chǎn)量是4.2×107個(gè)/毫升，原生質(zhì)體的再生率為0。在此基礎(chǔ)上不斷加大滲穩(wěn)劑的濃度，可以看出原生質(zhì)體的產(chǎn)量和再生率均呈現(xiàn)先增大后減小的變化。通過(guò)觀察試驗(yàn)曲線可以發(fā)現(xiàn)，當(dāng)滲穩(wěn)劑濃度低于0.2摩爾/升時(shí)，隨著度增加，原生質(zhì)體再生率提升明顯，此后隨著濃度增加原生質(zhì)體再生率無(wú)明顯變化；經(jīng)過(guò)回歸方程計(jì)算：當(dāng)滲穩(wěn)劑濃度為0.51摩爾/升時(shí)，原生質(zhì)體產(chǎn)量達(dá)到最高1.85×108個(gè)/毫升，當(dāng)穩(wěn)滲劑的濃度為0.33摩爾/升的時(shí)候，原生質(zhì)體的再生率會(huì)達(dá)到最大值1.97%。

2.7 pH對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)量與再生率的影響

通過(guò)觀察下圖6，可以發(fā)現(xiàn)當(dāng)滲穩(wěn)劑pH處于3～4時(shí)，原生質(zhì)體的產(chǎn)量基本上是穩(wěn)定沒(méi)有變化，原生質(zhì)體的再生率為0；當(dāng)處于4～5時(shí)，對(duì)于原生質(zhì)體的產(chǎn)量和再生率都有顯著的提升刺激；當(dāng)處于5～7時(shí)，原生質(zhì)體的產(chǎn)量與再生率都會(huì)出現(xiàn)不同程度的下降，回歸分析后得出，當(dāng)pH為5.10時(shí)，原生質(zhì)體的產(chǎn)量可達(dá)到最大值，為2.34×108個(gè)/毫升，當(dāng)pH為5.69時(shí)，原生質(zhì)體的再生率可達(dá)到最大值，為1.86%。

3 小結(jié)與討論

供給試驗(yàn)使用的幾種因素在固定限度之中時(shí)，都能夠提升原生質(zhì)體的產(chǎn)量以及再生率，并且具有明顯的效果。原生質(zhì)體的最佳制備條件為，在pH為5.0的條件下，使用0.5摩爾/升硫酸鎂作為穩(wěn)滲劑，在溫度達(dá)到28℃的時(shí)候?qū)?日齡菌絲進(jìn)行酶解3小時(shí)。最佳再生條件為，在pH為5.5的條件下，使用0.5摩爾/升蔗糖作為穩(wěn)滲劑，在溫度達(dá)到27.8℃的時(shí)候?qū)?.5日齡菌絲進(jìn)行酶解2.9小時(shí)。

酶活和酶解的反應(yīng)時(shí)間將會(huì)決定原生質(zhì)體的產(chǎn)量大小，各種因素對(duì)原生質(zhì)體的產(chǎn)量所造成的影響效果由小到大依次為，滲穩(wěn)劑、齡、菌酶解時(shí)間、酶解溫度。同時(shí)，酶活性受到酶解液pH和酶解溫度的影響，進(jìn)而影響原生質(zhì)體產(chǎn)量。當(dāng)pH為4.5～6.0范圍內(nèi)，則45～55℃為纖維素酶的最適宜溫度，30～37℃為蝸牛酶的最適宜溫度，酶促反應(yīng)的快慢與酶活性成正相關(guān)關(guān)系；同時(shí)混合酶的酶解效果要比單一酶效果顯著；在單位時(shí)間內(nèi)，混合酶產(chǎn)生的原生質(zhì)體的數(shù)量要大于單一酶所產(chǎn)生的原生質(zhì)體的數(shù)量。

原生質(zhì)體活性的大小可直接決定原生質(zhì)體再生率的大小，本次研究中選取的各項(xiàng)因素對(duì)于原生質(zhì)體再生率影響效果由小到大分別是，酶解溫度、菌齡、酶解時(shí)間、滲穩(wěn)劑濃度。滲穩(wěn)劑的濃度過(guò)大會(huì)導(dǎo)致原生質(zhì)體失水失活、滲穩(wěn)劑濃度過(guò)小會(huì)導(dǎo)致原生質(zhì)體脹破，這都會(huì)影響原生質(zhì)體的再生率。當(dāng)反應(yīng)酶處于其適宜反應(yīng)條件時(shí)，酶解的反應(yīng)比較快速，因?yàn)榛旌厦赶的軌驅(qū)Ω鞣N各樣的底物進(jìn)行酶解反應(yīng)，但是，隨著酶解時(shí)間不斷增加，原生質(zhì)體膜暴露時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致其細(xì)胞壁再生下降。因此，原生再生率也將會(huì)減弱。溫度為（25±1）℃時(shí)，是香菇菌絲和原生質(zhì)體的最佳生長(zhǎng)溫度，過(guò)高或者過(guò)低均會(huì)影響再生率。

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