我國是全球最大的水產(chǎn)養(yǎng)殖國家，養(yǎng)殖水產(chǎn)品總量逐年增長。據(jù)統(tǒng)計，2019 年我國養(yǎng)殖水產(chǎn)品總產(chǎn)量達(dá) 6 450 萬 t，超過世界養(yǎng)殖水產(chǎn)品總量的 70%，為優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)的供給以及國家的糧食安全做出了巨大貢獻(xiàn)。目前，高密度、集約化已成為我國水產(chǎn)養(yǎng)殖的主要模式，然而，養(yǎng)殖密度的不斷提高極易打破池塘原有的生態(tài)平衡，過多的殘餌、糞便無法被池塘中的微生物分解利用，導(dǎo)致氨氮、亞硝酸鹽等有害物質(zhì)積累，影響?zhàn)B殖動物健康。此外，不經(jīng)處理的養(yǎng)殖廢水排放到外環(huán)境中產(chǎn)生面源污染，危害養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。生物脫氮不僅安全環(huán)保，而且具有可續(xù)持性，近年來新發(fā)現(xiàn)的好氧反硝化細(xì)菌因其能夠在有氧的條件下進(jìn)行 反 硝 化 作 用，脫 氮 徹 底，而且具有適應(yīng)性強(qiáng)、生長速度快及容易控制等潛在優(yōu)點，逐漸成為脫氮益生菌中研究和應(yīng)用的熱點。

在益生菌研究和應(yīng)用中，菌種篩選是一個十分重要的環(huán)節(jié)。然而，由于在菌種篩選過程中候選菌株眾多而且篩選條件各異，水產(chǎn)養(yǎng)殖常用的益生菌菌種篩選的方法、標(biāo)準(zhǔn)非常繁雜，導(dǎo)致菌種篩選效率低下; 次，實驗室篩選得到的菌種在養(yǎng)殖試驗驗證過程中，其功能往往不能較好的重現(xiàn)，這主要是由于實驗室篩選益生菌的條件或許同其應(yīng)用的環(huán)境有所區(qū)別，從而使益生菌應(yīng)用后在靶位點難以生長、定植及發(fā)揮功能; 此外，某些對哺乳動物有益的微生物應(yīng)用于水生動物可能會產(chǎn)生不利影響。因此，在益生菌菌種篩選過程中制定適合水產(chǎn)養(yǎng)殖的方法、標(biāo)準(zhǔn)就顯得非常重要。目前，已有很多關(guān)于水產(chǎn)養(yǎng)殖中好氧反硝化菌種篩選應(yīng)用的研究］，但尚未見到對該菌種篩選及評價方法進(jìn)行系統(tǒng)綜述的報道。因此，本文對水產(chǎn)養(yǎng)殖中好氧反硝化細(xì)菌的篩選、評價方法進(jìn)行歸納、總結(jié)，以期對好氧反硝化細(xì)菌篩選和評價標(biāo)準(zhǔn) 提 供 參 考，并對未來的研究方向進(jìn)行了展望。

1 菌種篩選流程

隨著研究的深入，已有大量好氧反硝化細(xì)菌的研究 報 道，主 要 菌 種 包 括: 假 單 胞 (Pseudomonas sp．)、芽孢桿菌( Bacillus sp．) 、副球菌 Paracoccus sp．) 、海 桿 菌(Marinobacter sp．)、鹽 單 胞 菌 ( Halomonas sp．)  和 紅 球 菌( hodococcus sp．) 等，然而，尚缺乏對該菌種篩選和評價的系統(tǒng)報道。通過歸納、總結(jié)國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)，好氧反硝化菌種篩選流程和標(biāo)準(zhǔn)如圖 1所示。具體而言，好氧反硝化細(xì)菌的篩選包括了樣品采集、富集培養(yǎng)、安全性評估、菌種鑒定、耐受性評估、功能性評估及應(yīng)用試驗評估等主要組成步驟。通過層層篩選，獲得的菌種需要符合安全性、適應(yīng)性、功能性和便利性等特點.

2 樣品處理

理想的益生菌，應(yīng)該能夠在宿主的腸道或環(huán)境中定殖、建立和繁殖，然而，某些應(yīng)用于水產(chǎn)動的益生菌常出現(xiàn)相對無效的情況，這或許是由于非魚類來源的益生菌無法在其腸道中生存或保持最佳的活菌數(shù)?；诖?，好氧反硝化菌種分離常采集的樣本最好選取池塘的水樣、沉積物、微生物絮團(tuán)及水產(chǎn)動物腸道等樣本，從這些樣本中篩得的菌種具有更好的適應(yīng)性，即原位 /宿主益 菌 策 略autochthonousprobiotics/hostassociated probiotic) 。以往研究也發(fā)現(xiàn)，在水、泥、沉積物及生物絮團(tuán)樣品中更易篩得好氧反硝化細(xì)菌，如濱海芽孢桿菌( Bacillus litoralis) 、枯草芽孢桿菌( Bacillus subtilis) 、施氏假單胞菌( Pseudomonas stutzeri)  及 Paracoccus saliphilus 等 菌 種，且具有較好的適應(yīng)性。此外，采集的樣本還可以用高濃度的硝酸鹽、亞硝酸鹽及銨鹽作為唯一氮源進(jìn)行富集培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中需要進(jìn)行間歇曝氣以達(dá)到好氧反硝化微生物數(shù)量增加，同時確保目的菌種的好氧反硝化性能不退化或可得到進(jìn)一步加強(qiáng)，通過富集培養(yǎng)可大幅度提高后續(xù)菌種的篩選效率。

3 菌種初篩

好氧反硝化菌株初步篩選可應(yīng)用溴百里酚藍(lán)( bromothymol blue，BTB) 固體培養(yǎng)基，接種的細(xì)菌由于反硝化作用使 pH 升高，從而產(chǎn)生藍(lán)色暈圈，選取藍(lán)色菌落即可實現(xiàn)菌種的初篩。應(yīng)用該方法，從循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)的生物濾池中分離到好氧條件下能脫氮的菌株 Z1 和 Z8，Song 等］分離篩選得到高效脫氮的好氧反硝化菌株凝結(jié)芽孢桿菌( Bacillus coagulans) XY-6，也篩選 得 到 脫 氮 性 能 較 好 的 好 氧 反 硝 化 菌 種Pseudomonas sp． B5。根據(jù)篩選流程，初篩獲得的菌種還需要進(jìn)行安全性評估、菌種鑒定及耐受性評價。

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