2 PCR-DGGE在環(huán)境微生物學(xué)中的應(yīng)用

2.1 微生物多樣性

由于不需要了解單菌特征，PCR-D G G E已被 廣泛用于廢水生物處理過程中總體細(xì)菌種群或者 
具體細(xì)菌種群的遺傳多樣性分析。1993年 ，基于 l 6SrDNA片 段 的 PCR-DGGE首先被應(yīng)用于微生 物群落和生物膜的群落復(fù)雜性分析[2]。Curtis等采 用 PCR-D G G E比較了不同污水處理廠的活性污 泥中總微生物群落的多樣性。Gillan等 [l9]采用 PCR-DGGE并結(jié)合序列克隆分析了雙殼類生物的殼 上生物膜中微生物群落組成。陳紅歌等w 采用PCRDGGE研究了垃圾填埋場細(xì)菌種群空間分布及組成多 樣性。殷峻爭11 應(yīng)用PCR-DGGE技術(shù)研究處理含氨廢 氣的生物濾塔中微生物多樣性及處理時(shí)間對生物多樣 性的影響。

ward等[22]采 用 PCR-DGGE研究了溫泉中微 生物群落的動(dòng)態(tài)變化。劉 新 春 等 [23]采 用 PCRDGGE法解析了活性污泥系統(tǒng)中微生物群落結(jié)構(gòu) 變化，比較了常溫條件下運(yùn)行的2 種不同的活性 污泥系統(tǒng)中微生物群落結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)變化。由于工藝相 同，使得接種的低溫群落和常溫群落在相同的操作 條件下，產(chǎn)生相似的微生物群落結(jié)構(gòu)。滕應(yīng)等[24]用 PCR-DGGE分析了重金屬污染的農(nóng)田土壤中微生 物多樣性及群落動(dòng)態(tài)的變化。電泳圖譜表明， PCR產(chǎn)物經(jīng)DGGE檢測后得到的電泳條帶清晰且分離 效果好，可明顯反映出重金屬復(fù)合污染導(dǎo)致了農(nóng) 田土壤微生物在基因上的損傷，影響到農(nóng)田土壤 生態(tài)系統(tǒng)的細(xì)菌豐富度，改變了土壤環(huán)境的優(yōu)勢 群落，從而使農(nóng)田土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的多樣性 發(fā)生變化。

2.2微生物群落的動(dòng)態(tài)變化

PCR-DGGE的最大優(yōu)勢之一是可以同時(shí)分析 多個(gè)樣品，是檢測環(huán)境變化后引起微生物群落變化 
的一個(gè)強(qiáng)有力的工具。Donner等跟蹤了遠(yuǎn)洋的 動(dòng)態(tài)變化過程中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和活性的連續(xù)變 
化。從不同時(shí)間、不同地點(diǎn)的水樣提取的細(xì)菌總 DNA的 16S rDNA PCR-DGGE條帶變化反映纖維 素酶和酯酶的酶活性的變化。Santegoeds等[262結(jié)合 微傳感器和PCR-DGGE技術(shù)監(jiān)測了生長的細(xì)菌 生物膜中群落的變化、硫酸還原菌的開始、缺氧區(qū) 的變化。DGGE結(jié)果顯示:伴隨著生物膜的生長，觀 察到的DGGE條帶數(shù)増多，表明細(xì)菌種類的増多。 Ferris等口采用DGGE研究了熱泉微生物膜中溫 度梯度變化時(shí)微生物群落的分布變化。DGGE條 帶分析表明相同溫度的同一位置和不同位置的樣 品具有相似的DGGE條帶，但是不同溫度時(shí)具有 不同的條帶。

2.3富集和篩選過程中菌株的分析和跟蹤

PCR-DGGE除了可以研究微生物群落的復(fù)雜 性 ，還可以監(jiān)測富集培養(yǎng)過程中的微生物。1996 
年,Santegoeds等[282使 用PCR-DGGE監(jiān)測熱泉藻青 群 落 中 好 氧 化 能 有 機(jī) 營 養(yǎng) 細(xì) 菌 的 富 集 培 養(yǎng) 。 Felske等 采 用 PCR-DGGE跟蹤了分離的細(xì)菌樣 品在豐富培養(yǎng)基上的培養(yǎng)效率等。Teske等/092使用 rDNA片 段 DGGE跟蹤混合培養(yǎng)和純培養(yǎng)過程中 細(xì)菌菌株的篩選分離過程，并分離得到 2 個(gè)菌株， Desulf Ovibrio 和 Arcobacter Brinkhoff 等米用特定 的 16SrDNA的PCR2DGGE結(jié)合微生物學(xué)技術(shù)從環(huán) 境中分離出7 株新的硫酸氧化菌Thiomicrospira，而無 
需通過選擇性培養(yǎng)和富集培養(yǎng)來篩選分離。然后， 采用專一性Thiomicrospira探 針 對 PCR2DGGE帶 進(jìn)行基因雜交檢測和跟蹤目標(biāo)位置的 Thiomicrospira Jaspers 等使用 PCR-DGGE 結(jié)合等 點(diǎn)聚焦的方法分離并跟蹤不同細(xì)菌。

2.4氨化菌、硝化菌及反硝化菌的分析與跟蹤

生物脫氮過程中有氨化細(xì)菌（ammoniaoxidizing bacteria ， AOB) 、 亞硝酸菌 (Nit rosomonas) 、硝酸菌(Nitrobacter) 和反硝化菌的參與。這些菌 的種類十分豐富，其群落結(jié)構(gòu)和動(dòng)態(tài)變化會(huì)影響微 生物的脫氮效率。其中，A O B菌參與的氧化反應(yīng)是 硝化反應(yīng)的限速步驟，A O B在自然環(huán)境中數(shù)量小、 生長速率慢并且生物量低，因此很難通過傳統(tǒng)的純 培養(yǎng)篩選分離。然而，PCR2DGGE技術(shù)可以對自然 環(huán) 境 中 A O B 的分類和分布提供更完整的信息。 C!bron等 采 用 PCR-DGGE研究了從巴黎馬恩河 (Marne River) 出 口到翁弗勒爾(Honfleur)河口的一 
段長為 365 k m 的富含氨的塞納河(Seine River) 的 A O B群落。DGGE結(jié)果表明A O B主要有兩大群 落 ：一類是！ -Proteobacteria 綱中的 Nit rosomonas 和 Nit rosospira;另一類是"-Proteobacteria 綱中的 Nit rosococcus oceani 和 N . halophil us 。不同的 A O B菌屬和菌系之間的生理和生態(tài)學(xué)特征是不同 的。A O B群落分布會(huì)受進(jìn)水特性、時(shí)間、空間、鹽 度、pH、氨濃度和固體腰浮顆粒等因素影響。來自 于進(jìn)水中A O B可以保持它們的生物量甚至生長, 
有利于江河中氨污染的解決。Rowan等 W 采用 PCR2DGGE研究了水處理反應(yīng)器中AOB群落的組成 和多樣性。Avrahami等研究了溫度對A O B菌種群 結(jié)構(gòu)的直接或間接影響。Bollmann等研究了饑餓 對 AOB 的影響。Silyn-Roberts 等[31]利用 DGGE 在 線分析了生物膜中的硝化菌Nit rosomonas spp。

2.5 硫酸還原菌 & Sulfate.reducing bacteria，SRB)的 分析與跟蹤

DGGE被用于跟蹤微生物群落中S R B的群落 結(jié)構(gòu)及其隨時(shí)間、空間的動(dòng)態(tài)變化。Teske等[322采用 PCR-DGGE分析丹麥的瑪麗艾厄（Mariager) 海域 的分層河床中S R B的活性和種類，證實(shí)了 SR B的 多樣性。用 DGGE分析和比較了不同深度的PCR 產(chǎn)物和核酸RT-P C R產(chǎn)物，只有兩類活性微生物 菌株存在，并且占的比例很低。米 用 Desulf onema 的專一性寡核苷酸探針對16SrDNA片段的DGGE 條帶進(jìn)行雜交分析，確定了 Desulf onema菌的分 布情況。
Santegoeds 等[33]用 16S rDNA DGGE 研究了來自污水處理廠的生物膜中SR B種群的變化和硫酸 還原的優(yōu)化。在生物膜的生長過程中，微生物群落 的遺傳多樣性増多。用專一性寡核苷酸探針對 DGGE條帶進(jìn)行雜交分析，在所有的生物膜和活 性污泥樣品中， Desulf obulbus 和 Desulf ovibrio 是 主要的S$ B ，在好氧層內(nèi)部的厭氧區(qū)存在一種隸 屬 于 Desulf onema的絲狀SRB。但是在第 6 周和 第 8 周可以發(fā)現(xiàn)不同種類的 Desulf obulbus和 Desulf ovibrio。

3 發(fā)展前景

近 年 來 ，人 們 在 生 物 反 應(yīng) 器 中 應(yīng) 用 PCRDGGE技術(shù)檢測不同Desulf ovibrio群落中[NiFe] 氫化酶的不同表達(dá)。> a? e r等：34=首次使用DGGE分 析了 Desulfovibrio菌株中[NiFe]氣化酶基因以及不 同生物膜中Desulf ovibrio菌的系統(tǒng)多樣性。通過 對 總 D N A和 m$ N A 的 P C R產(chǎn)物的DGGE條帶進(jìn) 行分析比較，至少發(fā)現(xiàn)有兩類Desulf ovibrio菌 ，但 是只有其中的一類Desulf ovibrio菌可以優(yōu)勢的表 達(dá)[ NiFe ]氫化酶?？衫靡寻l(fā)現(xiàn)的功能基因，如氨 單加氧酶(AMO) 基因、亞硫酸還原酶基因等，進(jìn)行 PCR-DGGE分析微生物群落的功能菌的變化。此 
外 ，D G G E的發(fā)展可以促進(jìn)分析微生物群落復(fù)雜 性 的 其 它 基 因 指 紋 技 術(shù) 的 發(fā) 展 。 比 如 ，16S rRNAPCR -SSCP ( single strand conformation polymor-phism) 技術(shù)被用于研究天然細(xì)菌群落的 多 樣 性 。 ARDRA (amplified ribosomal DNA rest riction analysis) [35]也被用于分析混合微生物群落的 基因多樣性。Kowalchuk等[36]證明了 RNA DGGE 分析方法也是一種檢測微生物群落變化的快速方 法 ，它可檢測分析DNA DGGE技術(shù)很難檢測到的 活性群落。

盡 管PCR-DGGE存在著一些缺陷，但它具備 的顯著優(yōu)點(diǎn)不僅使得人們對復(fù)雜微生態(tài)系統(tǒng)的解 
析成為可能，也使得對微生物群落動(dòng)態(tài)變化的研 究成為可能，是一種非常適合分析廢水生物處理 過程中微生物群落的多樣性及動(dòng)態(tài)變化的基因指 紋技術(shù)。這也是PCR-DGGE深受人們關(guān)注的最重 要的原因。自Muyzer等[U]開辟了 PCR-DGGE在環(huán)境微生物學(xué)領(lǐng)域研究的先河以來，該技術(shù)迅速引 起微生物生態(tài)學(xué)家的關(guān)注，現(xiàn)已發(fā)展成為環(huán)境微 生物群落結(jié)構(gòu)分析研究的主要手段之一。在環(huán)境 微生物學(xué)領(lǐng)域，一個(gè)令人興奮的新方向是利用功 能基因作為分子標(biāo)記物研究代謝活性。

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