聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction), 簡(jiǎn) 稱 PCR,是一種分子生物學(xué)技術(shù)，用于放大特定 的 DNA片段，可看作生物體外的特殊DNA復(fù)制， 是一種體外擴(kuò)増核酸序列從而得到多個(gè)核酸拷貝 的技術(shù)。根據(jù)擴(kuò)増的模板、引物序列來(lái)源及反應(yīng)條 件的不同可將PC R技術(shù)分為以下幾種$(1)反轉(zhuǎn)錄 PCR技術(shù)，即在mRNA反轉(zhuǎn)錄之后進(jìn)行的PC R擴(kuò)増 ，可以用來(lái)分析不同生長(zhǎng)時(shí)期的mRNA表達(dá)狀 態(tài)的相關(guān)性；(2)競(jìng) 爭(zhēng) PCR,即一種定量PCR,通過(guò) 向 PC R反應(yīng)體系中加人人工構(gòu)建的帶有突變的競(jìng) 爭(zhēng)模板、控制競(jìng)爭(zhēng)模板的濃度來(lái)確定目的模板的 濃度，對(duì)目的模板作定量研究；（3)擴(kuò)増的rDNA限 制酶切分析技術(shù)，是美國(guó)最新發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)現(xiàn) 代生物鑒定技術(shù)，它根據(jù)原核生物rDNA序列的保 守性，將擴(kuò)増的rDNA片段進(jìn)行酶切，然后通過(guò)酶 切圖譜來(lái)分析菌間的多樣性。

變 性 梯 度 凝 膠 電 泳 （ denaturing gradient gelelect rophoresis，DGGE) 技術(shù)應(yīng)用于微生物生態(tài)學(xué)已經(jīng)歷 1 0 多年，它對(duì)各種環(huán)境中的微生物群體 研究起到了重要作用。D GGE是應(yīng)用于染色體 D N A點(diǎn) 變 異 檢 測(cè) 的 方 法 。 1 9 9 2年荷蘭科學(xué)家 Gerard Muyzer在西班牙召開的第6 次微生物生態(tài) 學(xué)會(huì)議上，首次介紹了 DGGE技術(shù)在微生物生態(tài) 學(xué)研究上應(yīng)用的可能性516。1993年 Muyzer等526首次 將 DGGE用于微生物研究，更加完整和準(zhǔn)確地描 述了微生物種群多樣性、數(shù)量比例和系統(tǒng)進(jìn)化等。 它的分辨精度比瓊脂糖電泳和聚丙烯酰胺凝膠電 泳更高，可以檢測(cè)到一個(gè)核苷酸水平的差異。本文 綜述了 PC9 - D GGE技術(shù)的基本原理和過(guò)程及其 在研究微生物群落多樣性、微生物群落動(dòng)態(tài)變化 等領(lǐng)域中的應(yīng)用，為快速和準(zhǔn)確地分析微生物菌 群組成、動(dòng)態(tài)變化及特種菌的跟蹤等提供了一個(gè) 非常有效的分子生物學(xué)技術(shù)。

1 PCR- DGGE的原理與方法

1.1 基本原理
PC9 -DGGE是利用尿素及甲酰胺2 種變性物 質(zhì)制成一種由低至高濃度的變性梯度電泳膠，由 
于變性物質(zhì)的作用，膠體上進(jìn)行電泳的雙股DNA 序列會(huì)產(chǎn)生部分變性，形成部分單鏈（ partial single strand)，隨著每一個(gè)D N A樣品核酸序列的不同，部 分變性解離的程度也不相同，因此其在電泳膠中 的移動(dòng)速度也有所不同(雙股快、單股慢)，使得部 分變性的D N A會(huì)在相同時(shí)間內(nèi)，在膠體上跑出不 同的距離。而 D N A變性的程度則與其解鏈溫度 (melting point ,Tm) 有 關(guān) ，不同序列的D N A會(huì)有不 同的Tm，低 T m 的 DNA會(huì)在低濃度的變性物質(zhì)作 用下產(chǎn)生變性形成部分單鏈，而高T m 的 DNA則 必須在高濃度的變性物質(zhì)作用下才會(huì)產(chǎn)生變性。 因此，利 用 DGGE可以將大小相同、序列組成不同 的 D N A鑒別開來(lái)。

1.2 PCR-DGGE 流程

PC9 - DGGE的基本流程是，首先從環(huán)境中取 得樣本，如地下水、活性污泥、生物膜等，進(jìn)行微生 物 總 D N A的提 取 ；然后通過(guò)聚合酶連鎖反應(yīng) ( PC9 ) 將提取的總D N A中的特定序列進(jìn)行擴(kuò)増， 其擴(kuò)増產(chǎn)物利用DGGE進(jìn)行分離；最后，對(duì) DGGE帶進(jìn)行測(cè)序并鑒定分析或者被印漬在尼龍膜上與 標(biāo)記的寡核苷酸專一性探針進(jìn)行雜交，鑒定群落成 員。在 PC9 - DGGE分子生物技術(shù)中，樣品總DNA 的提取和純化是前提，引物設(shè)計(jì)及其PC9 方式是 關(guān)鍵。為了更好的顯示DGGE條帶，可以選擇不同 的染色方式（EB、SYB9 Green I536和銀染)。其 中 ， SYB9 Green I 染色的優(yōu)點(diǎn)是背景色低，可以觀察 到盡可能多的條帶;銀染的靈敏度最高，但銀染過(guò) 后的條帶不能用于雜交分析546。

1.3 總 D N A 提取

沉淀物、活性污泥和生物膜等樣品中細(xì)菌種 類復(fù)雜且混雜有大量有毒物質(zhì)，如何使所有細(xì)胞裂 
解、充分釋放DNA、有效去除雜質(zhì)，建立高效、可靠 的 D N A提取方法 成 為 研 究 者 關(guān) 注 的 熱 點(diǎn) ?？?nbsp;D N A提取首先需要對(duì)樣品進(jìn)行解絮凝和破碎細(xì) 胞 ，然后萃取總DNA ,最后純化DNA。解絮凝和破 碎細(xì)胞常用的方法有Bead-beating法 、冷凍-解凍 法、酶法、化學(xué)法(表面活性劑或堿）、超聲破碎、液 氮下研磨、Q IT或者它們的組合等。Bead-beating 法 ，即微生物細(xì)胞在苯酚或SD S萃取液中用玻璃 珠將細(xì)胞打碎、破壁,該法最大的缺點(diǎn)是含有大量 的腐殖酸，且 D N A會(huì)被剪斷。酶法,即微生物細(xì)胞 分散在熱SDS溶液中，然后采用溶菌酶、蛋白酶Q 和蛋白酶E 等進(jìn)行處理?；瘜W(xué)法是采用化學(xué)試劑 使微生物細(xì)胞裂解，其混合液由多種表面活性劑、 
NaCl及各種緩沖液組成。Heuer等556比較了這些不 同的細(xì)胞破碎方法的功效和重復(fù)性及對(duì)D N A萃 取效率的影響。

在解絮凝和細(xì)胞破碎之后，進(jìn) 行 D N A萃取和 純化。將復(fù)雜的細(xì)胞分子混合物加人有機(jī)溶媒，除 去蛋白質(zhì)及其它成分，從而純化DNA。利用酚及氯 仿可使蛋白質(zhì)變性（denaturation) 的特性來(lái)進(jìn)行萃 取的步驟,D N A和 ：R N A不溶于有機(jī)溶媒中，而溶 于水層。另外，常利用瓊脂凝膠來(lái)分離不同大小的 D N A片段或用以純化DNA。目前從活性污泥中提 取 D N A的報(bào)道很多[6^ 。Miller等586比較了不同表 面活性劑(SDS、 Chelex 1 0 0、異硫氰酸胍）、不同物 理破碎方式(微珠機(jī)械研磨、冷凍-解凍裂解）和酶 消化等對(duì)D N A的提取率和分子量大小的影響。結(jié) 
果表明，用 SD S結(jié)合氯仿或苯酚進(jìn)行玻璃珠研磨可以優(yōu)化D# A 提取量及分子量。在 SDS處理前進(jìn) 行 溶 菌 酶 消 化 或 者 異 硫 氰 酸 胍 處 理 或 者 加 人 ChelexlOO樹脂都不能提高D N A產(chǎn)量。在一個(gè)含 有氯仿、SDS、N aC l和磷酸-Tris (pH 為 8)緩沖液 的混合裂解液中采用玻璃珠機(jī)械研磨是最好的物理 破碎方式。低速率、短時(shí)間(3〇!l 2Os)是玻璃珠機(jī)械研磨 的最佳條件。比較了 4 種 D N A純化方式(硅膠鍵合 DNA、凝膠電泳、醋酸銨沉淀和交聯(lián)葡聚糖G-2OO 
凝膠過(guò)濾)#表明交聯(lián)葡聚糖G-2OO柱純化是最好 的純化辦法。L eff等比較了 Ogram法[lO]、Tsai法[ll@ 和 Jacobsen法>l2@ 3 種方法。其中，Jacobsen法提取 的 D N A產(chǎn)量最低，但是純度最高；Ogram法提取 的時(shí)間最長(zhǎng)，D N A產(chǎn)量最高，但是純度一般;Tsai 法提取的時(shí)間最短，其產(chǎn)量中等，但是純度最低。

萃取效率、D N A的分子量大小和純度是DNA 萃取的關(guān)鍵指標(biāo)。Niemi等>l3@證明了 D N A分離和 純化過(guò)程影響樣品中微生物菌群的結(jié)構(gòu)。很多研 究人員米用改良方法來(lái)提高D N A的提取率和純 度。比如，Purohit等>l4@報(bào)道了在核酸預(yù)萃取之前, 用 pH 為 9~lO 的 5Oc c o I/L-1 Tris-HCl 進(jìn)行洗滌。 采 用 O.Ol Q 吐溫-2O 在 5O " 下進(jìn)行預(yù)處理，然后 用有機(jī)溶劑丙酮和石油醚萃取雜質(zhì)可以提高DNA 純度。此外，升溫(6O°C~沸騰）、加人苯酚或氯仿或 加人螯合劑（ED TA和 Chelex 1OO) 等措施也能提 高 D N A提取效率。

1.4 P C R 擴(kuò)增

P C T 擴(kuò) 増 是 PCT-DGGE技術(shù)中至關(guān)重要的 步驟。通常采用 16S rD N A中的保守區(qū)作為引物進(jìn) 行 P C T反應(yīng)。這是由于 16S rDNA[l5-l6@具有以下幾 個(gè)特點(diǎn)％ (l ) 16S rDNA約 為 15OO個(gè)核苷酸長(zhǎng)，序列 長(zhǎng)短適中,適合用作分類學(xué)上的研究；(2)任何一種 原核生物體都具有16S rDNA $ (3) 16S rDNA非常 保守;(4) 16S rDNA不會(huì)在不同的個(gè)體間進(jìn)行基因 交換，各物種具自己的獨(dú)特序列；(5)目前已有相當(dāng) 完 備 的 16S rDNA基因資料庫(kù)，經(jīng) 過(guò) GenBank和 
Tibosomal Database Project ( TDP) 基因資料庫(kù)作 對(duì)比分析，并可進(jìn)行親源關(guān)系分析、鑒定等。Y u等E17研 究了 16S rDNA 不同可變區(qū) V l 、V3 、V5 、V6 、V8 及 V l~V3 、V3~V5 、V6~V8 區(qū)的P C T 擴(kuò)増產(chǎn)物及 其 DGGE結(jié)果。結(jié)果表明擴(kuò)増V3 區(qū)及V3~V5 區(qū)的引物為最佳引物選擇。V3 區(qū)的PCT-DGGE條 帶數(shù)最多、分離效果最好。如果需要較長(zhǎng)的擴(kuò)増產(chǎn) 物 ，則選擇V3~V5 區(qū)。

為了提高DGGE的檢測(cè)敏感性，通常在一側(cè)引物 的 5 &端設(shè)計(jì)増加一段富含G C的區(qū)域(GC2Clamp， GC 鉗，其長(zhǎng)度通常為3O~5O個(gè)核苷酸）[18]，避免了 DNA 的完全解鏈，從而提高了不同堿基的檢出率；或者 對(duì)傳統(tǒng)的P C T模式進(jìn)行改良以提高D G G E的靈 敏度，巢 式 PCT(Nested PCT) 就是應(yīng)用最廣泛的一 種 ，它由兩輪P C R擴(kuò)増和利用兩套引物對(duì)所組成。 首先對(duì)靶DNA進(jìn) 行 第 l 步擴(kuò)増，然后從第l 次反 應(yīng)產(chǎn)物中取出少量作為反應(yīng)模板進(jìn)行第 2 次擴(kuò) 
増 ，第 2 次 P C R 引物與第l 次反應(yīng)產(chǎn)物的序列互 補(bǔ) ，第 2 次 P C R擴(kuò)増產(chǎn)物即為目的產(chǎn)物。

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