雞蛋富含多種優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)，是人們餐桌上常見(jiàn)的蛋白質(zhì)來(lái)源。蛋白質(zhì)主要分布在蛋清和蛋黃中，蛋清中蛋白以卵白蛋白、卵類(lèi)黏蛋白、卵黏蛋白以及伴白蛋白等形式存在；蛋黃中蛋白以高密度脂蛋白、低密度脂蛋白和肝素等形式存在。研究表明，雞蛋中多種蛋白具有抗氧化活性，其中，卵白蛋白作為蛋清蛋白的主要成分，約占54%，是一種由385個(gè)氨基酸組成的糖蛋白，含有6個(gè)具有二硫鍵的半胱氨酸殘基，是唯一含有游離硫醇基團(tuán)（SH）的蛋清蛋白，因而卵白蛋白能與自由基直接反應(yīng)，從而具有較強(qiáng)的抗氧化活性。Liu等為改善姜黃素的功能特性，利用卵白蛋白制成卵白蛋白-姜黃素復(fù)合物，與純姜黃素相比，復(fù)合物的抗氧化活性提高。

目前對(duì)卵白蛋白抗氧化性的研究主要集中在酶解或改性前、后體外活性評(píng)價(jià)。卵白蛋白最終對(duì)人體的健康益處與其在體內(nèi)的生物利用度密切相關(guān)。評(píng)價(jià)生物利用度有體內(nèi)和體外兩類(lèi)模型，體內(nèi)主要是動(dòng)物模型。動(dòng)物模型雖然能夠真實(shí)地還原生理?xiàng)l件下的消化過(guò)程，但是存在以下問(wèn)題：實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)，成本高，并且由于個(gè)體差異問(wèn)題，容易造成結(jié)果的重復(fù)性差。評(píng)價(jià)卵白蛋白生物利用度的體外模型主要是體外模擬胃腸道消化模型，體外模擬消化能夠在一定程度上模擬生理狀況，并且試驗(yàn)易操作，成本低、周期短。

本試驗(yàn)以卵白蛋白及其體外模擬胃腸道消化產(chǎn)物為研究對(duì)象，探究卵白蛋白經(jīng)體外模擬胃腸道消化后的抗氧化活性變化。測(cè)定其ABTS⁺·清除活性和ORAC，評(píng)價(jià)體外抗氧化活性。利用H₂O₂誘導(dǎo)Caco-2細(xì)胞氧化損傷，構(gòu)建細(xì)胞氧化損傷模型，探究其體內(nèi)抗氧化活性。以期闡明卵白蛋白經(jīng)體外模擬胃腸道消化后抗氧化活性變化規(guī)律，為后續(xù)研究蛋白及其產(chǎn)物在體內(nèi)消化、吸收提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

卵白蛋白、6-羥基-2，5，7，8-四甲基色烷-2-羧酸（6-hydroxy-2，5，7，8-tetramethylchroman-2-carboxylicacid，Trolox）、2’-聯(lián)氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2，2’-azino-bis（3-ethylbenzoth-iazoline-6-sulfonicacid），ABTS）、2，2’-偶氮二異丁基脒二鹽酸鹽（2，2’-azobis（2-methylpropi-onamidine）dihydrochloride，AAPH）、熒光素鈉、細(xì)胞內(nèi)ROS檢測(cè)試劑盒等，美國(guó)Sigma公司；合成肽CFDV、CVSP、MPFR（純度＞95%），生工生物工程（上海）股份有限公司；人結(jié)腸癌細(xì)胞（Caco-2），中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)；DMEM培養(yǎng)基，美國(guó)Gibco公司；H2O2（分析純），北京化工廠；細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒（MTS），美國(guó)Promega公司。

1.2 儀器與設(shè)備

電子天平，瑞士METTLERTOLEDO公司；多功能酶標(biāo)儀，美國(guó)伯騰儀器有限公司；黑色孔板（透明平底），德國(guó)GreinerBio-One公司；移液器，德國(guó)Eppendorf公司；超凈工作臺(tái)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；二氧化碳培養(yǎng)箱，上海力申科學(xué)儀器有限公司；低速離心機(jī)，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；倒置生物顯微鏡，重慶奧特光學(xué)儀器有限公司；EASY-nLC1000液相色譜儀，美國(guó)ThermoScientific公司；OrbitrapEliteTM組合型離子阱Orbitrap質(zhì)譜儀，美國(guó)ThermoScientific公司。

1.3 方法

1.3.1 體外模擬胃腸道消化

參照Alting等報(bào)道的方法并稍作修改。稱(chēng)取10g卵白蛋白，加入1L蒸餾水配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的蛋白溶液。加質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%的胃蛋白酶（EC3.4.23.1，來(lái)源于豬胃黏膜，酶活力為3000units），用1mol/L的HCl將pH值調(diào)至2，保持體系溫度在37℃，持續(xù)酶解90min。用1mol/L的NaOH調(diào)pH值至7，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%的胰液（EC3.4.21.4，來(lái)源于豬胰腺，酶活力為250units），保持溫度37℃和pH7，持續(xù)酶解4h。將體系沸水浴10min滅活蛋白酶，冷卻至室溫。將酶解液離心，在4℃下10000r/min離心10min，收集上清液，-20℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 卵白蛋白及其消化產(chǎn)物體外抗氧化活性測(cè)定

1.3.2.1 卵白蛋白及其消化產(chǎn)物ABTS⁺·清除能力測(cè)定

配制7mmol/LABTS溶液和4.9mmol/L的K₂S₂O₈溶液，將二者等體積混合配置得到ABTS儲(chǔ)備液。將儲(chǔ)備液于室溫避光條件下靜置12～16h后，用PBS將儲(chǔ)備液稀釋20～30倍，使其在734nm下的吸光度為0.7±0.02，形成ABTS工作液。96孔板按如下設(shè)置加入溶液：空白組：200μLPBS、對(duì)照組180μLABTS工作液和20μLPBS以及試驗(yàn)組：180μLABTS工作液和20μL樣品溶液（0.5，1，5和10μg/mL），每組3個(gè)復(fù)孔。將96孔板放入酶標(biāo)儀中，振蕩10s后，室溫靜置5min后，測(cè)定反應(yīng)體系在734nm下的吸光度值。計(jì)算ABTS自由基清除能力（%）的公式為：

式中：A₀—空白組的吸光度；A₁—對(duì)照組的吸光度；A₂—試驗(yàn)組的吸光度。

樣品的ABTS自由基清除能力用Trolox抗氧化當(dāng)量（TEAC，μmol/LTE/g樣品）表示，即一定濃度的樣品溶液相當(dāng)于多少濃度的Trolox溶液。

1.3.2.2 卵白蛋白及其消化產(chǎn)物ORAC測(cè)定

配制116nmol/L的熒光素鈉溶液和40mmol/L的AAPH溶液。在黑色96孔板中首先按如下設(shè)置加入溶液，空白組：120μL熒光素鈉溶液和20μLPBS；樣品組：120μL熒光素鈉溶液和20μL樣品溶液（10μg/mL）；Trolox組（標(biāo)準(zhǔn)品組）：120μL熒光素鈉溶液和20μLTrolox溶液（1μg/mL），混合上述體系，在37℃下預(yù)熱2min后，快速加入60μLAAPH溶液?jiǎn)?dòng)反應(yīng)。將黑色96孔板立即放入酶標(biāo)儀中，設(shè)置溫度37℃，激發(fā)波長(zhǎng)485nm，發(fā)射波長(zhǎng)520nm，每隔2min振板10s并檢測(cè)1次，連續(xù)測(cè)定600min。將每次測(cè)定值連成曲線，按下述公式計(jì)算熒光曲線下的面積：

式中：f₀—0min時(shí)的測(cè)定值；f_i—i，min時(shí)的測(cè)定值。Net，AUC按下述公式計(jì)算：

1.3.3 卵白蛋白及其消化產(chǎn)物的細(xì)胞抗氧化活性

1.3.3.1 卵白蛋白及其消化產(chǎn)物的毒性作用

Caco-2細(xì)胞按照參考文獻(xiàn)的方法進(jìn)行培養(yǎng)。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Caco-2細(xì)胞以2×10⁴cells/孔的密度接種于96孔板中，分別設(shè)置空白組、對(duì)照組和試驗(yàn)組，每個(gè)濃度6個(gè)復(fù)孔?？瞻捉M加入80μL的培養(yǎng)基，試驗(yàn)組和對(duì)照組加入80μL細(xì)胞懸液，于37℃、5%CO₂培養(yǎng)箱中孵育12h后，空白組和對(duì)照組加入10μLDMEM無(wú)血清高糖培養(yǎng)基，試驗(yàn)組分別加入10μL終質(zhì)量濃度為0.01，0.1，1mg/mL的樣品溶液，繼續(xù)孵育12h后，各組均加入10μLDMEM無(wú)血清高糖培養(yǎng)基，孵育6h后，利用MTS法測(cè)定細(xì)胞存活率。

1.3.3.2 H₂O₂誘導(dǎo)Caco-2細(xì)胞氧化損傷模型的建立

Caco-2細(xì)胞按照參考文獻(xiàn)的方法進(jìn)行培養(yǎng)。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Caco-2細(xì)胞以2×10⁴細(xì)胞/孔的密度接種于96孔板中，分別設(shè)置空白組、對(duì)照組和試驗(yàn)組，每個(gè)濃度6個(gè)復(fù)孔?？瞻捉M加入80μL的培養(yǎng)基，試驗(yàn)組和對(duì)照組加入80μL細(xì)胞懸液，于37℃、5%CO₂培養(yǎng)箱中孵育12h后，各組均加入10μLDMEM無(wú)血清高糖培養(yǎng)基，繼續(xù)孵育12h后，空白組和對(duì)照組加入10μLDMEM無(wú)血清高糖培養(yǎng)基，試驗(yàn)組分別加入10μL終濃度為400，500，600，700，800，900μmol/L的H₂O₂溶液，孵育6h后，利用MTS法測(cè)定細(xì)胞存活率。選取細(xì)胞存活率50%所對(duì)應(yīng)的H₂O₂濃度為構(gòu)建Caco-2細(xì)胞氧化損傷模型的最佳濃度。

1.3.3.3 卵白蛋白及其消化產(chǎn)物對(duì)Caco-2細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用

Caco-2細(xì)胞按照參考文獻(xiàn)的方法進(jìn)行培養(yǎng)。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Caco-2細(xì)胞以2×10⁴細(xì)胞/孔的密度接種于96孔板中，分別設(shè)置空白組、對(duì)照組和試驗(yàn)組，每個(gè)濃度6個(gè)復(fù)孔?？瞻捉M加入80μL的培養(yǎng)基，試驗(yàn)組和對(duì)照組加入80μL細(xì)胞懸液，于37℃、5%CO₂培養(yǎng)箱中孵育12h后，空白組和對(duì)照組加入10μLDMEM無(wú)血清高糖培養(yǎng)基，試驗(yàn)組分別加入10μL終質(zhì)量濃度為0.01，0.1，1mg/mL的樣品溶液，繼續(xù)孵育12h后，空白組和對(duì)照組加入10μLDMEM無(wú)血清高糖培養(yǎng)基，試驗(yàn)組加入10μL終濃度為700μmol/L的H₂O₂溶液，孵育6h后，利用MTS法測(cè)定細(xì)胞存活率。

相關(guān)鏈接：6-羥基-2，胃蛋白酶，熒光素，白蛋白

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