黃漿水是豆腐加工過程中的副產(chǎn)物，富含大豆異黃酮、蛋白質和維生素P、K等營養(yǎng)物質，以及大量水溶性的糖類，如水蘇糖、棉籽糖、蔗糖等，通常被直接排放，既浪費資源又污染環(huán)境。黃漿水在貯藏的過程中可自然發(fā)酵為酸漿，是一種良好的豆腐凝固劑。與石膏、鹵水作為凝固劑的豆腐相比，酸漿豆腐質地細膩、口感鮮嫩，深受人們喜愛。然而，自然發(fā)酵酸漿中含有大量的乳酸菌、酵母及其它微生物，也包括一些有害微生物，如蠟樣芽孢桿菌，造成酸漿質量不穩(wěn)定，并對酸漿豆腐的安全性構成威脅，從而限制了其工業(yè)化應用。

由于乳酸菌在酸漿形成過程中起主導作用，因此純種乳酸菌發(fā)酵制備酸漿成為趨勢。目前已有干酪乳桿菌、嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌、解淀粉乳桿菌等多種乳酸菌應用于黃漿水發(fā)酵中。由于人體不能產(chǎn)生α-半乳糖苷酶，因此黃漿水中的主要低聚糖—水蘇糖和棉籽糖等不能被人體消化利用，在腸道中被細菌發(fā)酵產(chǎn)氣，導致胃腸脹氣。研究表明有些乳酸菌，如鼠李糖乳桿菌、干酪乳桿菌等具有α-半乳糖苷酶活性，在發(fā)酵的過程中可利用大豆低聚糖緩解脹氣。另外，在乳酸菌發(fā)酵黃漿水的過程中，在β-葡萄糖苷酶的作用下，糖苷形式的大豆異黃酮可以轉化為更易吸收的游離型苷元大豆異黃酮，從而提高發(fā)酵黃漿水的抗氧化活性。

屎腸球菌（Enterococcusfaecium）屬于乳酸菌的一種，是腸道內(nèi)的正常菌群，廣泛存在于傳統(tǒng)乳制品、泡菜、豆醬等發(fā)酵食品中，具有耐酸、耐熱、腸道黏附能力強等特點，以及抑制病原菌、增強免疫力等作用。課題組前期從泡菜中篩選出1株屎腸球菌E.faeciumR2，該菌株可利用豆腐黃漿水中的低聚糖生長產(chǎn)酸，無需補充碳源和其它營養(yǎng)素即可達到豆腐凝固劑所需的酸度。采用該菌種純種發(fā)酵制備酸漿可有效降低大腸桿菌等的污染，既解決了自然發(fā)酵酸漿中微生物雜亂的問題，提高了酸漿豆腐的安全性，又可降低生產(chǎn)成本，具有廣泛的應用前景。為了更好地了解屎腸球菌R2對豆腐黃漿水的發(fā)酵特性，本研究采用HPLC法對屎腸球菌R2發(fā)酵豆腐黃漿水過程中的低聚糖、有機酸以及大豆異黃酮的組分和含量進行測定與分析，監(jiān)控發(fā)酵過程中α-半乳糖苷酶和β-葡萄糖苷酶活性的變化規(guī)律，并對發(fā)酵黃漿水的體外抗氧化活性進行評價，揭示屎腸球菌R2的發(fā)酵功能特性，以期為屎腸球菌R2的工業(yè)化應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

屎腸球菌E.faeciumR2，CGMCCNo.14944（專利保藏菌種），保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，由淮南師范學院食品質量與安全實驗室提供；食品級黃豆購于淮南蘇果超市；黃漿水，實驗室自制；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、Ｔrolox、大豆苷、大豆苷元、染料木苷、染料木素、黃豆黃素、大豆黃素苷、草酸、酒石酸、乳酸、檸檬酸、果糖、葡萄糖、棉籽糖、水蘇糖、蔗糖等標準品，美國Sigma公司；乙睛（色譜純）、乙酸（色譜純），天津科密歐化化學試劑有限公司；甲醇（色譜純），永華化學科技（江蘇）有限公司；對硝基苯酚、4-硝基苯-α-D-吡喃半乳糖苷、4-硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷，阿拉丁生化科技股份有限公司；其它試劑均為國產(chǎn)分析純。MRS液體培養(yǎng)基：蛋白胨10g，酵母浸粉5g，磷酸氫二鉀2g，檸檬酸二銨2g，葡萄糖20g，牛肉膏10g，無水乙酸鈉5g，硫酸鎂0.2g，硫酸錳0.05g，吐溫-801mL，121℃滅菌15min，冷卻備用。黃漿水培養(yǎng)基：將100mL黃漿水加入到250mL錐形瓶中，密封后121℃滅菌15min，冷卻備用。

1.2 儀器與設備

SW-CＪ-2D型超凈工作臺，蘇州凈化設備有限公司；LRH-250-A生化培養(yǎng)箱，廣東泰宏君科學儀器股份有限公司；LDZW-60KCS-ll型立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械；Ｔ6新世紀紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；5804R型離心機，Eppendorf公司；KQ-400B型超聲波清洗機，昆山超聲儀器有限公司；HPLC2998高效液相色譜，Waters公司；250mm×4.6mm5μm氨基柱、250mm×4.6mm5μmＴhermoC18柱，Aglient公司。

1.3 方法

1.3.1 黃漿水的制備

以傳統(tǒng)工藝制作的鹵水黃漿水作為初級黃漿水，初級黃漿水接種屎腸球菌發(fā)酵劑（接種量3%）發(fā)酵36h制得一代酸漿。以一代酸漿做為凝固劑制得二級豆腐黃漿水，再接種屎腸球菌發(fā)酵劑（接種量3%）發(fā)酵36h制得二代酸漿。以二代酸漿做凝固劑制得三級豆腐黃漿水，如此循環(huán)三代后消除原鹵鹽凝固劑的影響，試驗采用三代以后酸漿點制豆腐過程中所產(chǎn)生的黃漿水。

1.3.2 樣品制備

將活化后的屎腸球菌R2按3%接種量接入新鮮豆腐黃漿水培養(yǎng)基中，于37℃下靜置培養(yǎng)，獲得發(fā)酵0，12，24，36h的樣品，測定發(fā)酵過程中的屎腸球菌R2生物量和pH的變化趨勢。樣品經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾后供后續(xù)分析使用。

1.3.3 HPLC測定大豆低聚糖

色譜柱：Aglient氨基柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動相：70%乙腈-30%水（蔗糖、果糖、葡萄糖），68%乙腈-32%水（棉籽糖、水蘇糖）；流速：1.0mL/min；進樣量：10μL；柱溫：35℃；檢測器：示差折光檢測器。大豆低聚糖的標準曲線見表1。

1.3.4 HPLC測定有機酸

色譜柱：AgilentZORBAXSB-Aq（250mm×4.6mm，5μm）；ＴhermoC18柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動相：10mmol/L磷酸氫二鉀（用磷酸調(diào)pH為2.55）；流速：0.5mL/min；柱溫：30℃；進樣量：10μL。檢測器：紫外檢測器；波長：210nm。有機酸的標準曲線見表2。

1.3.5 HPLC測定大豆異黃酮

色譜柱：ＴhermoC18柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動相：A：0.1%乙酸乙腈溶液，B：0.1%乙酸溶液；流速：1.0mL/min，柱溫：30℃；進樣量：10μL。檢測器：紫外檢測器；波長：260nm。梯度洗脫條件按照GB/Ｔ26625-2011。大豆異黃酮標準曲線見表3。

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