②試樣測定：吸取試樣純化液lmL于比色皿中，以下操作同標準曲線的繪制。

5、計算

式中：x——試樣中維生素D的含量，mg/100g；

p——標準曲線上查得試樣溶液中維生素D含量，μg/mL，如按國際單位，每國際單位=0.025μg維生素D；

V——試樣提取后用三氯甲烷定容的體積，mL；

m——試樣質(zhì)量，g。

6、說明及注意事項

①本方法是A0AC選定的正式方法。本方法不能區(qū)分維生素D₂和維生素D₃，測定值是兩者的總量。

②食品中維生素D的含量一般很低，而維生素A、維生素E、膽固醇、甾醇等成分的含量往往都大大超過維生素D，嚴重干擾維生素D的測定，因此，測定前必須經(jīng)柱色譜除去這些干擾成分。

③操作時加入乙酰氯可以消除溫度的影響，可使靈敏度比僅用三氯化銻提高約3倍，并可減少部分甾醇的干擾。

三、水溶性維生素的測定——維生素C的測定(2，4-二硝基苯肼比色法)

1、原理

總維生素C包括還原型、脫氫型和二酮古樂糖酸。用酸處理過的活性炭把還原型維生素C氧化為脫氫維生素C，再繼續(xù)氧化為二酮古樂糖酸，二酮古樂糖酸再與2，4-二硝基苯肼作用生成紅色脎，根據(jù)脎在硫酸溶液中的含量與維生素C含量成正比，進行比色定量。

2、儀器

①恒溫箱：37°C±0.5°C。

②可見-紫外分光光度計。

③搗碎機。

3、試劑

①硫酸(4.5mol/L) 小心地加250mL濃硫酸(相對密度1.84)于700mL水中，冷卻后用水稀釋至1000mL。

②85％硫酸：小心地加900mL濃硫酸(相對密度1.84)于100mL水中。

③2，4-二硝基苯肼溶液(20g/L)：溶解2g 2，4-二硝基苯肼于100mL硫酸(4.5mol/L)中，過濾。不用時保存于冰箱中，每次用前必須過濾。

④草酸溶液(20g/L)：溶解20g草酸(H₂C₂O₄)于700mL水中，稀釋至1000mL；

⑤草酸溶液(10g/L)：取500mL草酸溶液(20g/L)稀釋至1000mL。

⑥硫脲溶液(10g/L)：溶解5g硫脲于，500mL草酸溶液(10g/L)中。

⑦硫脲溶液(20g/L)：溶解10g硫脲于500mL草酸溶液(10g/L)中。

⑧鹽酸(1mol/L)：取100mL鹽酸，加入水中，并稀釋至1200mL。

⑨維生素C標準溶液：稱取100mg純維生素C溶解于100mL草酸溶液(20g/L)中，此溶液每毫升相當于1mg維生素C。

⑩活性炭：將100g活性炭加到750mL鹽酸(1m0l/L)中，回流1～2h，過濾，用水洗數(shù)次，至濾液中無鐵離子(Fe³⁺)為止，然后置于110℃烘箱中烘干。

檢驗鐵離子的方法：利用普魯土藍反應(yīng)，將亞鐵氰化鉀(20g/L)與1％鹽酸等量混合，將上述洗出濾液滴入，如有鐵離子則產(chǎn)生藍色沉淀。

4、操作方法

(1)試樣的制備

①鮮樣的制備：稱取100g鮮樣及吸取l00mL20g/L，草酸溶液，倒入搗碎機中打成勻漿，取10～40g勻漿(含1～2mg維生素C)倒入100mL容量瓶中，用草酸溶液(10g/L)稀釋至刻度，混勻。

②干樣制備：稱1～4g干樣(含1～2mg維生素C)放入乳缽內(nèi)，加入草酸溶液(10g/L)磨成勻漿，倒入100mIL容量瓶中用草酸溶液(10g/L)稀釋至刻度，混勻。

將上述試樣過濾，濾液備用。不易過濾的試樣可用離心機離心后，傾出上清液，過濾，備用。

(2)氧化處理：取25mL上述濾液，加入2g活性炭，振搖1min，過濾，棄去最初數(shù)毫升濾液。取10mL此氧化提取液，加入10mL硫脲溶液(20g/L)，混勻，此試樣為稀釋液。

(3)顯色反應(yīng)

①于三個試管中各加入4mL氧化處理的稀釋液，一個試管作為空白，在其余試管中加入1.0mL 2，4-二硝基苯肼溶液(20g/L)將所有試管放入(37±0.5)℃恒溫箱或水浴中保溫3h。

②3h后取出，除空白管外，將所有試管放入冰水中?？瞻坠苋〕龊笫蛊淅鋮s至室溫，然后加入1.0mL 2，4-二硝基苯肼溶液(20g/L)，在室溫中放置10～15min后放入冰水內(nèi)。其余步驟同試樣。

(4)85％硫酸處理：當試管放入冰水后，向每一試管中加入5mL 85％硫酸，滴加時間至少需要1min，需邊加邊搖動試管。將試管自冰水中取出，在室溫下放置30min后比色。

(5)比色:用1cm比色皿，以空白液調(diào)零點，于500nm波長測吸光值。

(6)標準曲線的繪制

①加2g活性炭于50mL標準溶液中，振搖1min，過濾。

②取10mL濾液放入500mL容量瓶中，加5.0g硫脲，用草酸溶液(10g/L)稀釋至刻度，維生素C濃度20μg/mL。

③取5mL、10mL、20mL、25mL、40mL、50mL、60mL稀釋液，分別放入7個100mL容量瓶中，用硫脲溶液(10g/L)稀釋至刻度，使最后稀釋液中維生素C的濃度分別為1μg/mL、2μg/mL、4μg/mL、5μg/mL、8μg/mL、10μg/mL、12μg/mL。

④按試樣測定步驟形成脎，并比色。

⑤吸光值為縱坐標，維生素C濃度(μg/mL)為橫坐標，繪制標準曲線或求得回歸方程。

5、計算

式中：X——試樣中總維生素C的含量，mg/100g；

c——由標準曲線查得或由回歸方程算得的試樣氧化液中總維生素C的濃度，μg/mL。

V——試樣用10g/L草酸溶液定容的體積，mL；

m——試樣的質(zhì)量，g。

計算結(jié)果表示到小數(shù)點后兩位。

6、說明及注意事項

①本方法為GB/T 5009.86--2003標準第二法，第一法為熒光法。此外還有2，6-二氯靛酚滴定法、高效液相色譜法等。

②全部實驗過程應(yīng)避光進行操作。

③加入85％硫酸后試管從冰水中取出，溶液的顏色會繼續(xù)變深，所以必須計算好，加入硫酸后準時0.5h比色。

④硫脲可防止維生素C被氧化，且可幫助脎的形成，最終溶液中硫脲的濃度均需一致，否則影響色度。

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