1.3.6 生物膜形成能力的測定

參照KuSada等的方法，采用結(jié)晶紫染色法分析大蒜提取物對(duì)細(xì)菌生物膜形成能力的影響。將細(xì)菌培養(yǎng)液按1∶1000的比例稀釋，加入無菌96孔板中，加入不同濃度的大蒜提取物（終質(zhì)量濃度為0.15～1.20mg/mL），30℃靜置培養(yǎng)24h。移除培養(yǎng)液，用無菌去離子水沖洗3次，無菌風(fēng)干燥，加入200μL0.1%結(jié)晶紫染色液，室溫染色15mIn，無菌水沖洗3次，加入1mL95%乙醇漂洗生物膜，將洗液于波長570nm處測定OD值。

參照PackIavaThｙ等的方法，利用激光共聚焦顯微鏡（cLSm）分析細(xì)菌生物膜結(jié)構(gòu)的變化。將細(xì)菌培養(yǎng)液按1%的比例接入含1mLLB培養(yǎng)基的24孔板中，加入1.20mg/mL大蒜提取物和直徑為1cm的圓形蓋玻片，靜置培養(yǎng)24h。用無菌水輕輕沖洗玻片上未粘附的細(xì)胞，0.1%吖啶橙染色1mIn。洗去多余的染色液，將蓋玻片置顯微鏡下觀察。該顯微鏡裝有激發(fā)波長為515～560nm的激發(fā)濾光器及60×（60倍）的油鏡，其熒光顯微鏡照片與光鏡照片均由FluovIewv5.0軟件獲得

1.3.7 基因表達(dá)量的測定

采用實(shí)時(shí)熒光定量PcR（RT-PcR）技術(shù)。細(xì)菌活化后加入1.20mg/mL大蒜提取物培養(yǎng)24h，利用細(xì)菌RnA提取試劑盒提取細(xì)菌RnA。在20μL反應(yīng)體系中，加入10μL2×熒光定量PcR預(yù)混體系，0.4μL10μmol/L上、下游引物，2μLcDnA模板。PcR擴(kuò)增程序?yàn)椋侯A(yù)變性95℃3mIn，變性95℃7S，退火57℃10S，延伸72℃15S（45個(gè)循環(huán)）。相對(duì)表達(dá)量（RQ）由2-ΔΔcT方法計(jì)算得出。

1.3.8 細(xì)菌腐敗能力的測定

參照Zhao等的方法制備無菌魚糜肉汁。冷凍魚糜解凍后，按質(zhì)量比1∶1加水打漿，加熱煮沸5mIn后靜置，冷卻至室溫。用2層紗布過濾得魚糜肉汁，加入1.6g/L氧化三甲胺、40mg/LL-半胱氨酸和40mg/LL甲硫氨酸，混合均勻后于121℃高壓滅菌15mIn，得無菌魚糜肉汁。無菌條件下，在魚糜肉汁中添加不同質(zhì)量濃度的大蒜提取物（終質(zhì)量濃度為0.15～1.20mg/mL）。將制備好的細(xì)菌菌懸液接種至無菌魚糜肉汁中，于30℃中搖床培養(yǎng)48h，每間隔6h取樣，測定魚糜肉汁中TVB-n和腐胺含量變化。

TVB-n的測定參照趙丹丹等的方法，取5mL樣品，加入15mL0.6mol/L高氯酸溶液均質(zhì)混勻，上清液用半自動(dòng)凱氏定氮儀測定。腐胺含量的測定參照Zhao等的方法，取2mL樣品，加入25mL0.4mol/L高氯酸溶液均質(zhì)混勻，上清液用丹磺酰氯衍生后用高效液相色譜分析。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

運(yùn)用SPSS21.0軟件和OrIgIn8.5軟件分析數(shù)據(jù)。測定結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（n≥3）表示，采用最小顯著差異法（LSD）進(jìn)行顯著性差異分析，顯著性水平為5%。

2 結(jié)果與分析

2.1 維氏氣單胞菌產(chǎn)AHLs信號(hào)分子的種類

以根癌農(nóng)桿菌為報(bào)告菌，利用平行劃線法分析維氏氣單胞菌的AHLS分子產(chǎn)生情況，結(jié)果見圖1。細(xì)菌產(chǎn)生的AHLS可通過瓊脂擴(kuò)散誘導(dǎo)根癌農(nóng)桿菌產(chǎn)生β-半乳糖苷酶，并分解底物X-gal產(chǎn)生藍(lán)色色素。由圖1可知，維氏氣單胞菌可產(chǎn)生AHLS類信號(hào)分子并誘導(dǎo)根癌農(nóng)桿菌顯藍(lán)色。

根癌農(nóng)桿菌對(duì)不同碳鏈長度或帶有不同基團(tuán)的AHLS分子敏感程度不同，這些AHLS經(jīng)TLc展開，在培養(yǎng)基相應(yīng)的位置誘導(dǎo)根癌農(nóng)桿菌呈現(xiàn)藍(lán)色斑點(diǎn)。根據(jù)斑點(diǎn)的比移值、形狀和顏色深、淺可直觀判斷AHLS的種類及相對(duì)含量。對(duì)維氏氣單胞菌的AHLS提取液的TLc分析結(jié)果見圖2。分析可知，該細(xì)菌至少產(chǎn)生3種AHLS分子，即：c6-HSL、c7-HSL和c8-HSL。c4-HSL與c6-HSL是目前氣單胞菌屬報(bào)道最多的2種AHLS信號(hào)分子。LI等在腐敗比目魚中分離的溫和氣單胞菌中檢測到c4-HSL、c6-HSL、c8-HSL、N-癸?；?高絲氨酸內(nèi)酯（c10-HSL）和n十二酰基-高絲氨酸內(nèi)酯（c12-HSL）。本試驗(yàn)在維氏氣單胞菌中檢測到側(cè)鏈上的碳原子數(shù)目為奇數(shù)的AHL信號(hào)分子，即c7-HSL。

2.2 維氏氣單胞菌生長過程中AHLs活性變化

細(xì)菌產(chǎn)生的AHLS分子濃度受細(xì)菌密度變化影響，不同生長階段的細(xì)菌AHLS提取液能誘導(dǎo)根癌農(nóng)桿菌產(chǎn)生不同直徑的藍(lán)色圈。維氏氣單胞菌生長過程中的細(xì)菌總數(shù)與培養(yǎng)液PH值的變化見圖3，AHLS活性變化見圖4。分析可知，細(xì)菌培養(yǎng)4h時(shí)處于對(duì)數(shù)生長期初期，此時(shí)細(xì)菌分泌的AHLS可誘導(dǎo)根癌農(nóng)桿菌顯藍(lán)色。在4～10h細(xì)菌的快速生長階段，根癌農(nóng)桿菌的變色直徑不斷增大，說明AHLS的含量快速累積。在10～18h時(shí)，根癌農(nóng)桿菌藍(lán)色圈的直徑最大，此時(shí)培養(yǎng)液中AHLS濃度最高。在18～48h，細(xì)菌處于生長穩(wěn)定期，誘導(dǎo)報(bào)告菌變色的直徑減小，說明AHLS的濃度開始降低。研究發(fā)現(xiàn)，AHLS含量的減少與環(huán)境PH值升高有關(guān)。AHLS的高絲氨酸內(nèi)酯環(huán)在堿性條件下結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，易解環(huán)。對(duì)細(xì)菌生長過程中培養(yǎng)液的PH值變化的分析表明：細(xì)菌培養(yǎng)18h后培養(yǎng)液的PH值由6.92增至8.11，培養(yǎng)48h時(shí)PH值達(dá)8.97。隨著細(xì)菌的生長，培養(yǎng)液的PH值不斷升高，AHLS開始降解，活性降低。

2.3 維氏氣單胞菌的基因分析

革蘭氏陰性菌AHLS介導(dǎo)的群體感應(yīng)系統(tǒng)主要由luxRI的同源基因調(diào)控。利用PcR技術(shù)分析維氏氣單胞菌中的luxRI同源基因，結(jié)果見圖5a。分析發(fā)現(xiàn)2個(gè)片段序列分別為轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子AcuR和自誘導(dǎo)基因AcuI，這與ＪangId等的研究結(jié)果相同，該學(xué)者首次在維氏氣單胞菌mTcc3249中檢測到AcuRI群體感應(yīng)系統(tǒng)。此外，分析維氏氣單胞菌的氨基酸脫羧酶基因和毒力基因，結(jié)果見圖5b、5c。鳥氨酸脫羧酶基因（ODC）和賴氨酸脫羧酶基因（LDC）的檢出說明該細(xì)菌具有產(chǎn)腐胺和尸胺的能力，胞外酶基因（AhyB，ser，liP）的檢出說明該菌具有一定的蛋白酶活性和脂肪酶活性，鞭毛基因（flA）的檢出說明該菌具有鞭毛運(yùn)動(dòng)和形成生物膜的能力。

2.4 大蒜提取物對(duì)維氏氣單胞菌產(chǎn)AHLs的抑制作用

大蒜提取物對(duì)維氏氣單胞菌的最小抑菌質(zhì)量濃度為2.5mg/mL（數(shù)據(jù)未顯示）。本試驗(yàn)選擇低于此質(zhì)量濃度的系列（0，0.15，0.3，0.6，1.2mg/mL）來研究大蒜提取物對(duì)維氏氣單胞菌群體感應(yīng)的干擾作用。

通過檢測生物報(bào)告菌根癌農(nóng)桿菌的β-半乳糖苷酶活性來分析不同濃度大蒜提取物對(duì)維氏氣單胞菌產(chǎn)生AHLS活性的干擾作用，結(jié)果見圖6。分析可知，隨著大蒜提取物質(zhì)量濃度的增加（0～1.20mg/mL），根癌農(nóng)桿菌的β-半乳糖苷酶活性不斷降低（P＜0.05）。這說明大蒜提取物對(duì)維氏氣單胞菌產(chǎn)AHLS活性具有顯著的抑制作用（P＜0.05），且大蒜提取物的質(zhì)量濃度與其群體感應(yīng)抑制活性呈明顯量效關(guān)系。大蒜提取物質(zhì)量濃度為1.20mg/mL時(shí)對(duì)根癌農(nóng)桿菌的β-半乳糖苷酶活性的抑制率最高，為39.6%。這可能是因?yàn)榇速|(zhì)量濃度下維氏氣單胞菌AcuR蛋白與群體感應(yīng)抑制活性物質(zhì)的結(jié)合力最強(qiáng)，抑制了AHLS分子的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。

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