4、操作步驟

（1）試樣處理

①新鮮果蔬試樣：稱取鮮樣50.0g～100.0g，放入組織搗碎機(jī)的杯中，加入等重量的草酸浸提劑，快速搗碎1min，將試樣打成漿狀。試樣處理的整個(gè)過程應(yīng)在10min中內(nèi)完成，以免Vc被空氣氧化。用小燒杯稱取漿狀物10g～30g(準(zhǔn)確至0.lg，含還原型Vc1mg～5mg)，放入100mL容量瓶中，用草酸溶液定容，若有泡沫可加2滴辛醇除去。過濾，若濾液色深，影響滴定終點(diǎn)的判定時(shí)，可加1勺～2勺白陶土脫色。若樣液不易過濾，可用離心法分離。

②多汁果蔬試樣：可用紗布?jí)褐笤儆妹撝藁焖龠^濾，量取10mL～20mL汁液，立即用草酸溶液定容至100mL。

③干試樣稱?。?g～4g(準(zhǔn)確至0.001g，含還原型Vc 1mg～5mg)放入研缽中，加入草酸溶液研磨成漿狀液，洗入100mL容量瓶中，用草酸定容。

④含有還原性物質(zhì)的試樣含有較多Fe²⁺的樣品可用乙酸〔ψCH₃000H)=80%]代替草酸作為浸提劑。亞硫化脫水樣品，可于稀釋至一定容量之前加入20 mL丙酮，以除去SO₂的干擾。

（2）測(cè)定：吸取無色濾液5.00ml～10.00mL(使含Vc約0.2 mg～1mg范圍)放入50mL三角瓶中，用棕色半微量滴定管中裝的2,6-二氯靛酚標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至淺紅色，約在15s內(nèi)不褪色為終點(diǎn)。同時(shí)以浸提劑做空白試驗(yàn)(空白值約0.08mL～O.10mL)。

5、結(jié)果計(jì)算

Vc,mg·kg^-1=(V一V₀) ×1000×T÷m

式中:V——滴定樣品液所用染料溶液體積,mL;

Vo——滴定空白所用染料溶液體積,mL;

T——染料溶液的滴定度，mg·mL;

m——滴定時(shí)樣品溶液中樣品的質(zhì)量，g。

兩次測(cè)定結(jié)果允許誤差:

6、注意事項(xiàng)

（1）偏磷酸是Vc的最佳穩(wěn)定劑，且具有沉淀蛋白質(zhì)的作用。但其價(jià)格較貴，在室溫下放置易轉(zhuǎn)化為正磷酸，降低對(duì)Vc的穩(wěn)定性。草酸廉價(jià)易得，有與偏磷酸相近的穩(wěn)定性。而乙酸適于浸提含有Fe²⁺的樣品。

（2）草酸不應(yīng)置于日光下，以免產(chǎn)生過氧化物。當(dāng)有催化劑(如Cu2+)存在時(shí)，過氧化物能破壞Vc。

（3）6-二氯靛酚固體試劑有時(shí)含有分解產(chǎn)物，染料溶液長久貯存時(shí)也會(huì)生成分解產(chǎn)物，從而使滴定終點(diǎn)不靈敏，因此應(yīng)在使用前檢查。檢查方法:取15mL染料溶液加入過量的Vc溶液，若此時(shí)溶液仍帶有顏色，表示此溶液已不能使用。

（4）使用白陶土?xí)r，要對(duì)每批新的白陶土測(cè)定對(duì)Vc的回收率。

（5）試樣中可能有其它還原性物質(zhì)也可使染料還原。但其還原染料的速度較慢，故滴定終點(diǎn)以淺色在15s不褪色為準(zhǔn)。

四、維生素C總量的測(cè)定（2，4-二硝基苯肼比色法）

1、方法原理

維生紊C總量包括還原型Vc、脫氫型Vc和二酮古樂糖酸。先將試樣中的還原型抗壞血酸氧化為脫氫抗壞血酸，進(jìn)一步水解為二酮古樂糖酸。二酮古樂糖酸與2,4-二硝基苯肼偶聯(lián)生成紅色的脎。其呈色的強(qiáng)度與二酮古樂糖酸濃度成正比，可以比色定量。

2、試劑

（1）草酸溶液［(H₂C₂O₄·2H₂0)=10g·L^-1]:10g草酸[H₂C₂O₄·2H₂0，化學(xué)純〕溶于水，稀釋至1L;

（2）草酸溶液［((H₂C₂O₄·2H₂0)=20g·L^-1]:20g草酸((H₂C₂O₄·2H₂0，化學(xué)純)溶于水，稀釋至1L;

（3）酸處理活性炭:取活性炭200g，加入鹽酸溶液［ψ（HC1)=10%]100mL，煮沸后，抽氣過濾，再用沸水1000 mL煮沸過濾，重復(fù)用水洗至溶液中無Fe²⁺離子(用KSCN溶液試驗(yàn)無紅色)，放在100^oC～120℃烘干;

（4）2,4-二硝基苯肼溶液:稱取2,4-二硝基苯肼(C₆H₆N₄O₄，分析純)2.00g溶解于100 mL硫酸溶液中。

（5）硫酸溶液〔e(H₂SO₄)=4.5 mol·L^-1]:量取濃H₂S0₄(p=1.84g·cm^-3，分析純)250mL，慢慢倒入750mL水中，邊加邊攪拌。

（6）硫脲溶液:用50%乙醇溶液溶解5.00g硫脲[(NH₂)₂CS，分析純〕，使其最終體積為50mL。

（7）硫酸溶液:量取濃硫酸90mL，慢慢倒入10mL水中。

（8）標(biāo)準(zhǔn)Vc溶液:稱取VcO.020g溶解于草酸溶液中，移入lOOmL容量瓶中并定容，吸取此溶液50 mL，加入活性炭0.1g,搖1 min，過濾。吸取此溶液5mL于100mL容量瓶中，用草酸溶液(試劑1)稀釋定容。此Vc工作液為10mg·L^-1。

3、操作步驟

（1）試樣處理：稱取適量試樣加等量的草酸溶液，在組織搗碎機(jī)中打成漿狀。取漿狀物20g用草酸溶液移入100mL容量瓶中，定容過濾。

（2）試樣中總Vc的測(cè)定：取濾液10mL，加入草酸溶液10mL(總Vc約1mg·L^-1～10 mg·L^-1)，加一勺活性炭。搖1min,靜置過濾。

各取濾液2mL于樣品管和樣品空白管中，各管加入1滴硫脈溶液。于樣品管中加入2,4-二硝基苯磷溶液0.5mL，兩管都加上蓋子，里于37℃保溫箱中保溫3h。

然后取出樣品管放入冰水中(終止反應(yīng))。樣品空白管取出后冷卻至室溫，然后加入2,4-二硝基苯磷溶液0.5mL。然后將樣品管和樣品空白管皆置于冰浴中，從滴定管中滴加硫酸2 mL于各管中，邊滴邊搖試管(防止溶液溫度上升，溶液中糖炭化而轉(zhuǎn)黑色)。

將各管從冰裕中取出，在室溫下放置30min后，立即在分光光度計(jì)540nm波長處比色，讀取吸收值，根據(jù)吸收值從標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)含量。

（3）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：吸取Vc標(biāo)準(zhǔn)工作液10mL, 20mL, 30mL, 40mL, 50mL稀釋至50 mL，即此系列含有2mg·L^-1,4mg·L^-1,6mg·L^-1,8mg·L^-1,10mg·L^-1，的V_c標(biāo)準(zhǔn)溶液。各取2mL于各標(biāo)準(zhǔn)管中，然后按上述2步驟測(cè)定。以Vc濃度系列為橫座標(biāo)，以吸收值(A)為縱座標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

4、結(jié)果計(jì)算

式中:P——從標(biāo)準(zhǔn)曲線查得的mL稀釋液中所含總抗壞血酸的質(zhì)量mg·L^-1;

m——每1mL樣品稀釋液所含樣品的質(zhì)量，g;

10^-3——將mL換算成L的系數(shù);

1000——1000g樣品中總Vc的含量。

5、注意事項(xiàng)

（1）硫脲可防止Vc被氧化，且可幫助脎的形成，最終溶液中硫脈的濃度應(yīng)一致，否則影響色度。

（2）加入硫酸溶液后，試管從冰水中取出，溶液顏色會(huì)繼續(xù)變深，所以必須準(zhǔn)確加入H₂SO₄后于30min內(nèi)比色。

參考資料：土壤農(nóng)業(yè)化學(xué)分析方法