辣椒（CapsicumannuumL），原產(chǎn)于中拉丁美洲熱帶地區(qū)，在中國(guó)主要分布在四川、貴州、湖南、云南、河南等地。辣椒油樹脂（Capsicumoleoresin）是通過從辣椒中提取和濃縮而獲得的油狀液體混合物，它除了含有主要成分辣椒堿類物質(zhì)和辣椒紅色素（Capsanthin）外，還含有少量的脂肪酸、蛋白、果膠、多糖等其他化學(xué)物質(zhì)。

辣椒油樹脂是重要的食品加工原料，同時(shí)也是提取辣椒紅色素和辣椒堿的中間體，因具有抗氧化、抑菌和抗癌等生理活性，對(duì)于它的研究具有重要意義。KimJS等研究發(fā)現(xiàn)辣椒提取物因含有辣椒紅素和β-胡蘿卜素，對(duì)H2O2誘導(dǎo)間隙連接細(xì)胞間的通訊抑制有保護(hù)作用。這表明，其有助于降低氧化應(yīng)激引起的疾病風(fēng)險(xiǎn)。目前工業(yè)上對(duì)于辣椒油樹脂的提取主要有浸提法，即浸提干紅辣椒粉末后的濾液再經(jīng)減壓濃縮后得到辣椒油樹脂，但溶劑浸提法提取時(shí)間長(zhǎng)，效率低。Melgar-Lalanne，G等研究超聲輔助提取辣椒油樹脂，發(fā)現(xiàn)超聲提取不僅得率會(huì)有所提高，還會(huì)大幅縮短提取的時(shí)間，提高提取效率。本實(shí)驗(yàn)借助超聲輔助有機(jī)溶劑提取辣椒油樹脂，結(jié)合響應(yīng)面分析方法對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。并對(duì)其體外抗氧化活性和抑菌活性進(jìn)行探究，旨在對(duì)辣椒油樹脂的提取和綜合利用提供理論基礎(chǔ)。

一、材料與方法

1、試驗(yàn)材料與試劑

干紅辣椒（朝天椒），市售；95％乙醇、丙酮、正己烷、乙酸乙酯均為分析純；DPPH（1，1-二苯基-2-三硝基苯肼）（AR≥95％）、ABTS（2，2’-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）；測(cè)試菌種：金黃色葡萄球菌（staphylococcusaureus）、大腸桿菌（escherichiacoli）、枯草芽孢桿菌（bacillussubtilis）；培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。

2、儀器與設(shè)備

WJX-800A型高速多功能粉碎機(jī)；AL204電子分析天平；HRHS24型電熱恒溫水浴鍋；SP-2000UV型紫外可見分光光度計(jì)；SC-3614型低速離心機(jī)；101-2AB型電熱鼓風(fēng)干燥箱；SB-5200DT型超聲波清洗器；YSQ-LS-50Ⅱ立式蒸汽滅菌鍋。

3、提取試驗(yàn)

（1）辣椒油樹脂提取工藝

干紅辣椒經(jīng)清洗后置于電熱鼓風(fēng)干燥箱中65℃烘干至恒重。烘干后的辣椒經(jīng)過去蒂、除籽后進(jìn)行粉碎、過篩（45目篩），將辣椒粉置于棕色瓶中備用。準(zhǔn)確稱取29辣椒粉末，按8:1mL／g的液料比加入相應(yīng)體積溶劑，超聲輔助提取30min后，經(jīng)4000r／min離心10min后收集上清液，減壓濃縮得辣椒油樹脂。根據(jù)公式（1）計(jì)算辣椒油樹脂得率。

（2）溶劑的選擇

根據(jù)文獻(xiàn)例選擇丙酮、95％乙醇、乙酸乙酯、正己烷和乙醚5種機(jī)溶劑進(jìn)行浸提。準(zhǔn)確稱取5份原料樣品，分別加入相應(yīng)體積的丙酮、95％乙醇、乙酸乙酯、正己烷和乙醚，按相應(yīng)條件提取。辣椒油樹脂提取液經(jīng)過濾后，減壓濃縮，考察不同提取溶劑對(duì)辣椒油樹脂得率的影響。

（3）單因素試驗(yàn)

稱取2g辣椒粉末，以辣椒油樹脂得率為指標(biāo)，考察不同液料比（6:1、7:1、8:1、9:1、10:1mL／g）、超聲時(shí)間（15、20、25、30、35min）和超聲溫度（30℃、35℃、40℃、45℃、50℃）對(duì)辣椒油樹脂得率的影響。

（4）響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以單因素試驗(yàn)為依據(jù)，根據(jù)Box—Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，運(yùn)用Design-ExpertV8.0.6軟件程序，進(jìn)行三因素三水平試驗(yàn)，確定提取辣椒油樹脂最優(yōu)工藝條件。試驗(yàn)因素及水平見表1。

4、體外抗氧化活性研究

（1）還原力的測(cè)定

配制不同濃度的辣椒油樹脂樣品溶液，以VC為參照，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。量取2.5mL樣品溶液，加入等體積磷酸緩沖鹽溶液和1％的鐵氰化鉀溶液，水?。?0℃）反應(yīng)20min后迅速冷卻，加入2.5mL10％的CF3COOH溶液，取5mL反應(yīng)液，加入4mL的蒸餾水和1mL的0.1％三氯化鐵溶液，充分混勻，靜置10min后于700nm處測(cè)定吸光值，以蒸餾水為空白，重復(fù)三次。以樣品的吸光度表示辣椒油樹脂的還原能力，吸光值越大，還原力越強(qiáng)。

（2）DPPH自由基清除能力測(cè)定

精確稱取DPPH標(biāo)準(zhǔn)品0.0039g，用乙醇定溶至100mL。取2mL不同濃度的樣品溶液于試管中，分別加入2mL的DPPH溶液，搖勻后，避光反應(yīng)40min，在517nm處測(cè)得吸光值A(chǔ)s；同法取2mL乙醇加入等體積DPPH溶液，測(cè)其吸光度為Ab，樣品重復(fù)三次，取平均值。以VC為陽性對(duì)照，按公式（2）計(jì)算DPPH清除率。

（3）ABTS自由基清除能力測(cè)定

按1:1比例混合7mmol／L的ABTS和2.45mmol／L的K₂S₂O₈，黑暗中反應(yīng)12h，產(chǎn)生ABTS⁺，使用前用乙醇稀釋成備用的ABTS溶液（使其在734nm下吸光值為0.70+0.02）。吸取0.4mL不同濃度樣品溶液和4.0mLABTS溶液，反應(yīng)1min后，在734nm下測(cè)定吸光值A(chǔ)s，用蒸餾水做空白對(duì)照Ab，以VC作陽性對(duì)照，每組試驗(yàn)重復(fù)3次，按公式（3）計(jì)算ABTS自由基清除率。

5、抑菌活性研究

（1）菌種的活化及菌懸液的制備

將于4℃冰箱保存的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌接種于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上，于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。挑取活化好的菌種分別放入已盛有無菌生理鹽水的試管中，搖勻，制成菌懸液，使菌懸液中細(xì)菌數(shù)為1～2×10⁷個(gè)。

（2）抑菌效力測(cè)定

采用瓊脂打孔注入法。將高壓蒸汽滅菌后的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基趁熱倒入已滅菌的培養(yǎng)皿中，待培養(yǎng)基冷凝后加入0.1mL菌懸液，涂布均勻。用滅過菌的金屬打孔器（約6mm）在平板上打四個(gè)孔，并去除孔內(nèi)瓊脂。吸取不同濃度的辣椒油樹脂溶液0.1mL注入孔內(nèi)，以無菌生理鹽水為空白對(duì)照。然后把培養(yǎng)皿放在恒溫培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)24h后，觀察抑菌圈直徑大小。

（3）最低抑菌質(zhì)量濃度測(cè)定

通過二倍稀釋法將辣椒油樹脂提取物進(jìn)行梯度稀釋，制成0.156mg／mL、0.3125mg／mL、0.625mg／mL、1.25mg／mL、2.5mg／mL、5.0mg／mL、10.0mg／mL、20.0mg／mL濃度的樣品提取液。向已滅菌的培養(yǎng)基平板中分別添加不同濃度樣品稀釋液各0.1mL，再分別添加各試驗(yàn)菌菌懸液0.1mL，均勻涂布培養(yǎng)24h，重復(fù)三次，觀察結(jié)果。以不長(zhǎng)菌的平板對(duì)應(yīng)的樣品最低濃度即為最小抑菌濃度，以無菌生理鹽水為對(duì)照。

6、數(shù)據(jù)處理

利用Design-Expert.V8.0.6軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析。

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