香茅草為禾科植物香茅的全草，呈檸檬香味，別名檸檬草，在我國的華南、西南等地均有分布。香茅草精油有較好的抑菌活性，其中的香葉醛和橙花醛已被證實為香茅精油中的抗菌活性成分。香茅草精油被用于配制牙膏、香水、香精、驅(qū)蚊劑、殺蚊劑、化妝品等工業(yè)日化用品，還用于合成薄荷腦、消毒制劑、抑菌劑等，而且在天然的食品防腐劑開發(fā)領(lǐng)域有較為廣闊的應(yīng)用前景。

云南是香茅草的重要的種植區(qū)，種植面積大，以往對其利用率不高，主要用于食用和中草藥方面，目前很多學(xué)者已經(jīng)證實其在化妝品、醫(yī)藥各方面的功效，但香茅油的提取率很低，目前已報道的提取方法有：水蒸氣蒸餾法，超臨界CO₂萃取法，索氏提取法，微波輔助法。

水蒸汽蒸餾法雖然設(shè)備簡單，不易破壞有效成分，但提取率很低；索氏提取法的提取率高，但要加入有機試劑丙酮，會造成污染；超臨界CO₂萃取法能保護(hù)有效成分，但設(shè)備屬高壓設(shè)備，投資成本大；微波法有提取時間短、節(jié)能、操作簡單、出油率高的優(yōu)點。為獲得較高的出油率和較好的抑菌活性的香茅草精油，本文采用微波輔助水蒸氣蒸餾法提取香茅草精油，并對提取工藝的優(yōu)化，同時測定其對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的抑制作用。為香茅草利用途徑的開拓提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持。

一、材料與方法

1、材料與試劑

香茅草采于云南保山潞江鎮(zhèn)。

金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌。

氯化鈉、石油醚、無水硫酸鎂；牛肉膏、蛋白胨、葡萄糖、瓊脂。

2、儀器與設(shè)備

高壓蒸汽滅菌鍋HVE-50，生化培養(yǎng)箱SPX-250B-Z型，UV2600雙光束紫外可見分光光度計，氣質(zhì)聯(lián)用儀TraceDSQ。

3、實驗方法

（1）香茅草精油的提取

準(zhǔn)確稱取25g干香茅草葉部，按料液比加入一定體積的蒸餾水，浸泡12h后，在一定微波功率和微波時間下進(jìn)行輔助加熱5min，再加入一定量的NaCl和幾粒沸石，混合均勻，轉(zhuǎn)入500mL圓底燒瓶中，進(jìn)行水蒸氣蒸餾，蒸餾過程中記錄香茅草精油的外觀品質(zhì)和出油量，蒸餾結(jié)束后，無水MgSO₄干燥，收集精油置于棕色瓶中，密封4℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

出油率計算公式：

出油率（%）=（精油質(zhì)量／香茅草千重量）x100%。

（2）香茅草不同部位的精油出油率比較

分別稱取25g香茅草的干燥莖樣、干燥葉樣、鮮莖樣、鮮葉樣，浸泡12h后，在料液比1：15g／mL，NaCl質(zhì)量濃度1g／L，微波功率350W，微波時間5min，準(zhǔn)確稱取25g干香茅草葉部，按料液比加入一定體積的蒸餾水，浸泡12h后，在一定微波功率和微波時間下進(jìn)行輔助加熱5min，再加入一定量的NaCl和幾粒沸石，混合均勻，轉(zhuǎn)入500mL圓底燒瓶中，進(jìn)行水蒸氣蒸餾，蒸餾過程中記錄香茅草精油的外觀品質(zhì)和出油量，蒸餾結(jié)束后，無水MgSO₄干燥，收集精油置于棕色瓶中，密封4℃儲存?zhèn)溆?，進(jìn)行香茅草精油的提取，并計算總精油提取率。

（3）單因素試驗

選擇料液比（A）、氯化鈉質(zhì)量（B）、微波功率（C）和微波時間（D）進(jìn)行單因素實驗。固定料液比1：15g／mL，NaCl用量1g／L，微波功率350W，微波時間5min，分別考察單因素料液比（1：10、1：15、1：20、1：25）、NaCl質(zhì)量濃度（0.5g／L、1g／L、1.5g／L、2g／L、2.5g／L）微波功率（210W、350W、490W、700W）、微波時間（3min、4min、5min、6min）。

稱取25g干香茅草葉部，按料液比加入一定體積的蒸餾水，浸泡12h后，在一定微波功率和微波時間下進(jìn)行輔助加熱5min，再加入一定量的NaCl和幾粒沸石，混合均勻，轉(zhuǎn)入500mL圓底燒瓶中，進(jìn)行水蒸氣蒸餾，蒸餾過程中記錄香茅草精油的外觀品質(zhì)和出油量，蒸餾結(jié)束后，無水MgSO₄干燥，收集精油置于棕色瓶中，密封4℃儲存?zhèn)溆?，進(jìn)行香茅草精油的提取，并計算總精油提取率。

（4）正交實驗

根據(jù)正交試驗法以料液比A（g／mL）、NaCl質(zhì)量濃度B（g／L）、微波功率C（W）、微波時間D（min）為4個因素，每個因素設(shè)3個水平進(jìn)行L₉（3⁴）設(shè)計正交實驗確定香茅草精油提取的最佳條件。具體因素水平如表1。

（5）香茅草精油的GC-MS分析

將精油用色譜純級的甲醇配制成1mg／mL，無水硫酸鈉震蕩干燥后進(jìn)樣。GC-MS分析條件：

DB-17毛細(xì)柱（30Mx0.25mmx0.25μm），升溫程序：起始柱溫50℃，保持4min；以5℃／min升溫至70℃；20C／min升溫至120℃；10℃／min升溫至170℃；5℃／min升溫至200℃；40℃／min升溫至280℃。載氣為氦氣，流量：1.0mL／min，進(jìn)樣口溫度：230℃，進(jìn)樣量1μL。質(zhì)譜條件：離子源（EI），電轟擊能量70eV，離子源溫度：200℃。

（6）香茅草精油的抑菌活性測定

①菌種活化及菌懸液的制備用

接種環(huán)挑取適量的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌于LB液體培養(yǎng)基中進(jìn)行活化，37℃培養(yǎng)24h。挑取-環(huán)已活化的菌苔放入100mL無菌生理鹽水中，搖勻菌懸液，150r／min振蕩培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)24h。

②香茅草精油的抑菌效果測定

采用濾紙片法測定抑菌活性，每皿設(shè)計3片濾紙片。濾紙片法判定標(biāo)準(zhǔn)極敏：抑菌圈直徑＞20mm，高敏：抑菌圈直徑15～19mm，中敏：抑菌圈直徑10～15mm，低敏：抑菌圈直徑＜10mm。

具體方法為：制備牛肉膏蛋白胨瓊脂平板，用無菌移液器吸取200uL菌懸液（1.0x10⁶～10⁷CFU／mL）于平板上，采用涂布棒均勻涂布。用直徑為8.0mm并已滅菌后的濾紙片放入香茅草提取物中，浸泡1～2min后，將濾紙片放入培養(yǎng)基表面，每板放3張。將培養(yǎng)皿倒置于恒溫培養(yǎng)箱中，于37℃下培24h，觀察細(xì)菌生長情況，采用十字交叉法測定樣品的抑菌圈直徑，再對3種菌的無菌水空白和稀釋溶劑（60%乙醇）對照。實驗重復(fù)3次，取其平均值為測定結(jié)果。

③香茅草精油最低抑菌濃度（MIC）和最低殺菌濃度（MBC）的測定

采用2倍稀釋法，測定具有最大抑菌圈直徑香茅草提取物的MIC和MBC。以60%乙醇為溶劑，將香茅草的提取物配制成一系列梯度濃度的樣品溶液，分別為10.5、2.5、1.25、0.62.0.3、0.15.0.075mg／mL。量取0.1mL不同濃度的樣品溶液和0.1mL（1.0x10⁶～10⁷CFU／mL）供試菌菌懸液混合，混合液加入到裝有10mL牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基的試管中，37℃下恒溫培養(yǎng)24h后，各取1mL培養(yǎng)液涂布在平板培養(yǎng)基上，將各試管置于37℃下培養(yǎng)24～48h，觀察細(xì)菌生長情況，以完全無菌生長的濃度為其MIC。分別從樣品濃度不低于MIC的各試管中取1mL培養(yǎng)液于營養(yǎng)瓊脂平板上，涂布均勻后于37℃下繼續(xù)培養(yǎng)24h，觀察細(xì)菌生長情況。以仍無菌生長或菌落總數(shù)小于5的濃度為樣品的最低殺菌濃度。

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