廢用性肌肉萎縮是骨骼肌長期不受負荷引起形態(tài)、結構、功能發(fā)生改變的一種機體變化，可由禁食、臥床、肢體制動、失神經、失重等原因導致，同時也是心血管病、糖尿病等多種疾病的常見并發(fā)癥。根據(jù)2016全球疾病負擔報告所述，肌肉相關疾病是影響健康壽命損失年(YLD)的重要因素之一，近十年全球患肌肉相關疾病的人數(shù)比九十年代翻了一倍，且年齡標準化率增加60.7％。這一疾病不僅影響患者生活質量，嚴重時可帶來生命危險，也為國家財政帶來沉重負擔。因此尋找合適有效的治療肌肉萎縮的方法或進行早期預防，對臨床醫(yī)學、運動醫(yī)學和航天醫(yī)學等領域具有重要的科學意義及社會意義。

廢用性肌肉萎縮主要表現(xiàn)為肌肉質量和強度的降低、肌纖維變細或消失。大量研究表明，肌肉質量的多少是由蛋白質合成與蛋白質分解動態(tài)平衡決定的。當分解速率超過合成速率、蛋白質凈生成量減少時，發(fā)生肌肉萎縮。蛋白質代謝信號通路的核心物質是Akt(蛋白激酶B，PKB)?？刂频鞍踪|合成的重要途徑是由IGF-1介導的IGF-1／P13K／Akt／mTOR，可激活下游信號4EBPl和S6K1轉導，調節(jié)蛋白質的翻譯作用，促進蛋白質合成?？刂频鞍踪|分解的兩條重要途徑有泛素蛋白酶體途徑和自噬溶酶體途徑，其中肌肉萎縮相關基因和萎縮基因均由Akt的下游Fox03控制。當它具有活性時，可從細胞質自由進入核中，與MAFbx／Atrogin-l和MuRFl基因的多個啟動子相互作用，增加這兩種泛素連接酶E3的表達，促進由二者催化的泛素蛋白酶體途徑的進行，或通過影響溶酶體白噬途徑，加速蛋白質分解。此外，肌肉萎縮的發(fā)生也會伴隨氧化應激的出現(xiàn)。此時，機體內抗氧化物酶如SOD、GSH-Px濃度降低，ROS大量增多至超過機體處理能力，直接或間接導致蛋白質損傷，使細胞、組織或器官受損。

目前，除運動及功能訓練外，治療肌肉萎縮的方法主要有藥物干預和營養(yǎng)干預。藥物包括激素類(如生長激素、胰島素樣生長因子、中藥類、丹參、黃芪、抗氧化劑類(維生素E)等。但由于可能具有的潛在副作用，還需大量毒理實驗證實，因此營養(yǎng)干預方法受到越來越多的人們廣泛的關注。這些營養(yǎng)干預方法普遍從增加蛋白質合成、減少蛋白質分解或改善氧化應激等方面緩解肌肉萎縮癥狀。Beasley、夏志等研究表明，攝入富含亮氨酸等支鏈氨基酸的優(yōu)質蛋白如乳清蛋白，可改善骨骼肌丟失的狀況并可減輕體內引發(fā)的炎癥反應。Bueno等發(fā)現(xiàn)，給予病人包含益生元的營養(yǎng)組合物，可增加HMB內源性產生，進而增加mTOR濃度從而促進蛋白質合成。Murata等發(fā)現(xiàn)攝入花翠素可通過抑制MuRF-1表達起到預防肌肉萎縮的作用。Valcarce等研究發(fā)現(xiàn)，給予小分子PPAR-δ可通過增加肌纖維的線粒體密度增強有氧能力，治療肌肉萎縮。

大豆多肽是大豆蛋白酶解成的小分子產物，必需氨基酸齊全且平衡，同時較大豆蛋白更易消化吸收，因而具有廣闊的應用前景。目前關于大豆多肽對機體的功能性研究主要集中在抗氧化。治療燒傷、降血壓、調節(jié)血糖等方面，對蛋白質合成和分解的作用鮮有報道。因此，本文通過建立大鼠尾吊模型模擬失重，對大豆多肽對蛋白質代謝和氧化應激的影響進行深入探討，以期為營養(yǎng)干預預防和治療肌肉萎縮的方法提供一定參考。

一、材料與方法

1、材料與儀器

SPF級8周齡Wistar雄性大鼠(動物許可證號：SCXK(京)2016—0006，體質量260～280g)北京維通利華實驗動物技術有限公司；大鼠維持飼料斯貝福(北京)生物技術有限公司；大豆多肽(蛋白含量90％)諾利如一(安陽)生物科技有限公司；IGF-1ELISA檢測試劑盒、Fox03ELISA檢測試劑盒、SODELISA檢測試劑盒北京方程生物科技有限公司；普通RIPA裂解液(組織／細胞)北京索萊寶科技有限公司；BCA蛋白定量分析試劑盒、ECL免疫印跡底物賽默飛世爾科技(中國)有限公司；兔抗MAFbx／Fbx32／Atrogin-1單克隆抗體、兔抗GAPDH單克隆抗體、HRP標記的山羊抗兔lgG艾博抗(上海)貿易有限公司。

玻璃勻漿器。北京半夏科技發(fā)展有限公司；AllegraX一30R離心機美國貝克曼庫爾特有限公司；InfiniteM200Pro多功能酶標儀帝肯(上海)貿易有限公司；PowerPac通用電泳儀、Trans—BlotTurbo全能型蛋白轉印系統(tǒng)、ChemiDocMP全能型凝膠成像分析系統(tǒng)伯樂生命醫(yī)學產品(上海)有限公司。

2、實驗方法

（1）動物分組及灌胃設計

將35只大鼠分籠飼養(yǎng)，每天晝夜循環(huán)光照12h，環(huán)境溫度20～25℃，相對濕度50％～60％。自由進食進水，每天更換飼料和飲水。適應性喂養(yǎng)1周后，隨機選取15只用于驗證大豆多肽預防作用實驗，設為地面一對照組1(C1)、尾吊一對照組(M)、尾吊一肽組(T)，每組5只，灌胃40d；剩余20只用于驗證大豆多肽治療作用實驗，其中隨機選取5只作為地面一對照組(C2)，15只進行尾吊。飼養(yǎng)40d后，將15只尾吊大鼠放回地面，分為尾吊后一高劑量肽治療組(HT)、尾吊后一中劑量肽治療組(MT)、尾吊后一低劑量肽治療組(LT)，每組5只，與C2共同灌胃60d。參照Morey—HoltonE等的方法進行尾部懸吊，使大鼠后肢離地30ο、前肢可自由活動，隨大鼠生長及時調節(jié)尾吊高度。按照人體每天額外補充5g大豆多肽進行換算得到大鼠每天補充量并以此作為治療中劑量，即0.45g／(kg·BW·d)，治療高劑量和低劑量分別設為0.75g／(kg·BW·d)和0.15g／(kg·BW·d)。預防劑量設為0.30g／(kg·BW·d)。所有大鼠均按照0.50mL／(kg·BW-d)進行灌胃，對照組灌胃蒸餾水。

（2）血清和肌肉樣品采集

預防實驗中，于5、10、17、25、32、40d稱量大鼠體質量并記錄。治療實驗中，每周第4d和第7d稱量大鼠體質量并記錄，并于7、21、35d進行尾靜脈取血。預防實驗灌胃40d時，對C1、M、T組進行解剖。治療實驗灌胃60d時，對C2、HT、MT、LT組大鼠進行解剖。解剖前禁食不禁水12h。解剖時，麻醉后采用腹主動脈法取血。將血液室溫靜置1～2h，于4℃放置一夜。次日4℃、3000r·min^-1離心10min，取上層血清，-80℃保存?zhèn)溆?。取大鼠左側后肢腓腸肌和比目魚肌，分別稱量腓腸肌和比目魚肌濕重并計算腓腸肌和比目魚肌濕重／體質量比：腓腸肌或比目魚肌濕重／體質量比(mg／g)=腓腸肌或比目魚肌濕重／72鼠體質量，于-80℃凍藏備用。

(3)血清相關指標測定

采用雙抗體夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測大鼠血清中IGF-1、Fox03、SOD濃度。向包被對應待測物捕獲抗體的微孔中依次加入標準品／樣品、HRP標記的檢測抗體，37℃溫育1h，洗滌未結合的抗原抗體。加入底物TMB于37℃避光孵育30min進行顯色，用酶標儀在450nm波長下測定吸光度(OD值)，計算樣品中對應待測物濃度。

（4）總蛋白提取及蛋白定量

取0.1g肌肉組織剪碎，加入lmLRIPA裂解液(PMSF濃度為1mmol／L)，在冰水浴條件下用玻璃勻漿器研磨10min，冰上裂解30min。于4℃、12000r·min“離心10min，收集上清即提取的總蛋白，制得肌肉勻漿樣品，于-80℃保存?zhèn)溆?。采用BCA法對各個樣品進行蛋白定量，BSA蛋白標準曲線為：Y=0.6892x+0.0100，決定系數(shù)R2=0.9991。最終將樣品統(tǒng)一稀釋成同一蛋白濃度。

(5)WesternBlot分析

將樣品于100℃煮沸5min使蛋白充分變性，采用12％的十二烷基硫酸鈉一聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，濃縮膠濃度為5％。初始電壓為80V，20min后將電壓調至120V，約1h停止。將膠上蛋白轉移至PVDF膜，5％BSA中(溶于TBST)于37℃封閉2h，在1：1000稀釋的一抗中于4℃孵育過夜，TBST洗膜3次，每次5Bin。加入HRP標記的二抗于37℃孵育2h，TBST洗膜3次，每次5min。加入ECL化學發(fā)光底物對條帶進行染色，避光結合2min，在凝膠成像儀中對目的蛋白Atrogin-1和內參蛋白GAPDH進行顯影，利用ImageLab軟件對圖像進行分析。實驗重復3次。

3、數(shù)據(jù)處理

采用SPSS軟件中單因素方差分析(One-wayANOVA)的Turkey多重比較對數(shù)據(jù)進行分析。結果以“x±s”表示，P＜0.05或P＜0.01時判斷組間差異具有統(tǒng)計學意義。

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