甘草為豆科甘草屬烏拉爾甘草、脹果甘草或光果甘草的干燥根和根莖，多生長(zhǎng)在干旱、半干旱的草原、沙漠或丘陵地帶，是一味常用大宗藥材，被稱為“國(guó)老”，在中醫(yī)里有“十方九草”之說，不僅本身具有補(bǔ)脾益氣、清熱解毒、祛痰止咳、緩急止痛、抗氧化、保肝和增強(qiáng)記憶力的功效，還在中藥配伍中具有調(diào)和諸藥，以增加藥效的作用。

目前，從甘草中分離出的化合物有400多種，其中黃酮類化合物含量最多，且生物活性較強(qiáng)，其因連有異戊烯基，使得其脂溶性增加，具有抗炎、抗氧化抗病毒川、抗腫瘤、抗抑郁、鎮(zhèn)靜和鎮(zhèn)痛等功能，并對(duì)人類免疫缺陷病毒有較強(qiáng)的抑制增殖作用，其潛在的藥用價(jià)值巨大。目前的提取方法主要有：有機(jī)溶劑提取、堿性稀醇或堿性水提取、超聲提取、微波提取、超臨界萃取、酶解提取等方法。其中超聲提取法是不僅高效、省時(shí)、低成本，而且超聲波具有空化作用、熱效應(yīng)和機(jī)械攪拌等作用，在提取天然物質(zhì)時(shí)，對(duì)有效成分的破壞性小。

甘草渣是提取甘草酸后剩余的藥渣，有研究表明其中含有大量的黃酮類物質(zhì)，為了更高效的利用藥材，本實(shí)驗(yàn)以甘草渣為研究對(duì)象，對(duì)超聲輔助提取其總黃酮的工藝進(jìn)行了研究，得到最優(yōu)提取條件，并對(duì)其抗氧化能力進(jìn)行了考察，以期對(duì)今后甘草的利用和開發(fā)提供參考。

一、實(shí)驗(yàn)儀器與材料

1、實(shí)驗(yàn)材料與試劑

無(wú)水乙醇、氫氧化鉀：天津市永大化學(xué)試劑有限公司；硫酸亞鐵：天津市博迪化工股份有限公司；水楊酸：天津市百世化工有限公司；雙氧水：天津歐博凱化工股份公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）：日本光和純藥；維生素C：北京索萊寶科技有限公司；鐵氰化鉀：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；三氯乙酸：天津市永大化學(xué)試劑有限公司；以上試劑均為分析純。甘草苷：濰坊華植生物科技有限公司；甘草購(gòu)于石家莊某公司。

2、儀器

KQ5200DE型超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；SZF-06A型快速提取儀：上海新嘉電子有限公司；R201C型真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；TGL-10B型高速臺(tái)式離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；UV-6000PC型紫外可見分光光度計(jì)：上海元析儀器有限公司；DZF-6050型真空干燥箱：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；B-260型恒溫水浴鍋：上海亞榮生化儀器廠。

3、方法

（1）甘草苷對(duì)照品的配置

準(zhǔn)確稱取甘草苷15mg置于25mL容量瓶中，加入70%乙醇溶液至刻度，制成濃度為0.6mg/mL的甘草苷對(duì)照品溶液，置于4℃條件下，備用。

（2）甘草渣中總黃酮的提取

取適量甘草，粉碎，過60目篩后準(zhǔn)確稱取100.0g于燒杯中，加入含0.3%氨水的60%的乙醇水溶液500mL，80℃回流提取2次，每次2h，過濾后濾渣即為甘草渣，干燥后備用。

準(zhǔn)確稱取備用甘草渣2.0g于容器中，加入70%乙醇溶液，超聲處理后，在一定溫度下進(jìn)行回流提取。過濾后5000r/min離心10min，取上清液進(jìn)行濃縮、再用70%乙醇溶液進(jìn)行溶解定容至25mL即為樣品溶液，置于4℃條件下，備用。

（3）總黃酮的測(cè)定

準(zhǔn)確移取不同梯度濃度的對(duì)照品溶液于25mL的容量瓶中，加0.5mL的氫氧化鉀溶液（10%），震蕩使混合均勻，室溫下放置10min，70%乙醇溶液定容。以70%乙醇溶液作為空白對(duì)照，在400nm處測(cè)定其吸收值。以對(duì)照品溶液的濃度為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的吸光度值為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為Y=0.01799X+0.05153，R²=0.9991，結(jié)果表明在濃度為6ug/mL～60μg/mL的范圍內(nèi)，其濃度與吸光度呈良好的線性關(guān)系，見圖1。

移取0.8mL樣品溶液于25mL的容量瓶中，重復(fù)上述操作，測(cè)得其吸收值，帶入回歸方程中，得出其總黃酮的含量，按照公式（1）計(jì)算收率。

（4）單因素試驗(yàn)

①料液比對(duì)甘草渣總黃酮收率的影響

精確稱取2.0g甘草渣，分別以料液比1:25（g:mL）、1:30（g:mL）、1:35（g:mL）、1:40（g:mL）和1:45（g:mL）的比例加入70%乙醇溶液，超聲30min，在60℃下回流提取2h。

②超聲時(shí)間對(duì)甘草渣總黃酮收率的影響

精確稱取2.0g甘草渣，以料液比1:35（g:mL）的比例加入70%乙醇溶液，分別超聲10min、20min、30min、40min、50min和60min，在60℃下回流提取2h。

③提取時(shí)間對(duì)甘草渣總黃酮收率的影響

精確稱取2.0g甘草渣，以料液比1:35（g:mL）的比例加入70%乙醇溶液，超聲40min，在60℃下分別提取lh、2h、3h和4h。

④提取溫度對(duì)甘草渣總黃酮收率的影響

精確稱取2.0g甘草渣，以料液比1:35（g:mL）的比例加入70%乙醇溶液，超聲40min，分別在50℃、60℃、70℃、80℃和90℃下提取2h。

（5）響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇超聲時(shí)間、提取時(shí)間和提取溫度為自變量，以提取率為響應(yīng)值，進(jìn)行Box-Behnken響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，每個(gè)因素取3個(gè)水平，所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。具體因素實(shí)驗(yàn)水平見表1。

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