阿爾泰金蓮花（Trolliusaltaicus），為毛茛科金蓮花屬多年生草本植物，主要生長(zhǎng)于我國(guó)新疆阿勒泰、塔城地區(qū)，性苦寒，具有清熱解毒、消炎殺菌、止血止咳等功效，其干燥花蕾臨床上多用于呼吸道感染、急慢性咽炎和扁桃體炎等病癥的治療，當(dāng)?shù)孛耖g也將其泡水飲用以預(yù)防感冒等疾病。然而，作為商品金蓮花的來(lái)源藥材之一，該藥材的研究報(bào)道較少。葒草素半乳糖苷等黃酮碳苷類化合物是該藥材發(fā)揮藥效的主要活性成分，并進(jìn)一步探討了其總黃酮的回流提取工藝。超聲輔助提取是利用超聲波的強(qiáng)烈的振動(dòng)、空化、攪拌等效應(yīng)破壞植物細(xì)胞壁，促進(jìn)有效成分溶于提取溶劑中。酶輔助超聲提取法結(jié)合了酶法和超聲提取法的優(yōu)點(diǎn)，不僅提取時(shí)間短、提取效率高，且能較好地保持提取物的特性和品質(zhì)，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于中草藥活性成分的提取之中。本文擬通過(guò)考察酶制劑的種類、酶添加量、pH、料液比、提取時(shí)間、提取溫度以及提取功率對(duì)其所含黃酮提取率的影響，進(jìn)一步結(jié)合Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析，優(yōu)化阿爾泰金蓮花總黃酮的最佳酶輔助超聲提取工藝，為阿爾泰金蓮花及其總黃酮的深度開(kāi)發(fā)提供參考數(shù)據(jù)。

一、材料與方法

1、材料與試劑

阿爾泰金蓮花藥材于2016年8月采集于新疆阿勒泰地區(qū)，經(jīng)新疆藥物研究所何江副研究員鑒定為阿爾泰金蓮花T.altaicus的干燥花蕾，藥材粉碎，過(guò)40目篩。葒草素2-O-β-L-半乳糖苷對(duì)照品（OGA，上海源葉生物科技有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.0%，P31O7F23952）；纖維素酶:（4x10⁵U/g）、半纖維素酶（1x10⁵U/g）果膠酶（3x10⁵U/g）和中性蛋白酶（5x10⁵U/g）分別購(gòu)自上海如吉生物科技發(fā)展有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

2、儀器與設(shè)備

AS系列超聲波清洗機(jī)：天津歐特賽恩斯儀器有限公司；DZKW-S-4電熱恒溫水浴鍋：北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；AL204型分析天平：梅特勒-托利多儀器有限公司，751型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海菁華科技儀器有限公司。

3、實(shí)驗(yàn)方法

（1）對(duì)照品溶液的配制及標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

精密稱取干燥至恒重的OGA對(duì)照品5.0mg于25mL容量瓶中，用70%乙醇溶解、稀釋至刻度，搖勻、靜置，得0.20mg/mL的0GA對(duì)照品溶液，保存?zhèn)溆谩７謩e精密吸取對(duì)照品溶液0mL、l.0mL、2.0mL、3.0mL、5.0mL、7.0mL分別置于25mL容量瓶中，各加水至8.0mL，加5%亞硝酸鈉溶液1.0mL，混勻，放置6min后，加10%硝酸鋁溶液1.0mL，混勻放置6min后；再加4%氫氧化鈉試液10.0mL，加水至刻度，搖勻放置15min，以相應(yīng)試劑為空白，在500nm處測(cè)定吸光度（A），以A為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度（C）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y=0.523X-0.0109，R₂=0.9994，在0.008mg/mL～0.056mg/mL范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系關(guān)系。

（2）樣品溶液制備及其總黃酮測(cè)定

稱取一定量阿爾泰金蓮花，再分別向其中添加不同體積不同濃度的乙醇，加入酶，在一定溫度下分別超聲處理一定時(shí)間，制得供試樣品溶液。精密稱取干燥至恒重的OGA對(duì)照品5.0mg于25mL容量瓶中，用70%乙醇溶解、稀釋至刻度，搖勻、靜置，得0.20mg/mL的0GA對(duì)照品溶液，保存?zhèn)溆?。分別精密吸取對(duì)照品溶液0mL、l.0mL、2.0mL、3.0mL、5.0mL、7.0mL分別置于25mL容量瓶中，各加水至8.0mL，加5%亞硝酸鈉溶液1.0mL，混勻，放置6min后，加10%硝酸鋁溶液1.0mL，混勻放置6min后；再加4%氫氧化鈉試液10.0mL，加水至刻度，搖勻放置15min，以相應(yīng)試劑為空白，在500nm處測(cè)定吸光度（A），以A為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度（C）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y=0.523X-0.0109，R₂=0.9994，在0.008mg/mL～0.056mg/mL范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系關(guān)系。并計(jì)算提取率。阿爾泰金蓮花總黃酮提取率Y（%）=（C×V/M）x100%，式中：C為提取液中黃酮濃度（mg/mL），V為提取液體積（mL），M為藥材質(zhì)量（mg）。

（3）酶制劑的選擇

稱取1.0g阿爾泰金蓮花若干份，分別向其中加入占藥材質(zhì)量1.0%的纖維素酶、果膠酶、半纖維素酶、中性蛋白酶，將一份未加任何酶制劑的樣品作對(duì)照組。每份樣品分別加50倍量50%乙醇，加入鹽酸緩沖液，調(diào)pH分別設(shè)定3、4、5、6，將上述各組樣品于40℃，超聲功率90W下超聲提取30min酶解后，各組樣品經(jīng)滅酶（沸水浴5min），過(guò)濾得到上清液。分別從各組中取適量提取液，計(jì)算金蓮花總黃酮提取率。

（4）單因素試驗(yàn)

稱取藥材1.0g，分別對(duì)超聲酶輔助提取工藝中的影響因素（酶添加量、料液比、提取溫度、提取時(shí)間、超聲功率）進(jìn)行考察。酶添加量:0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、3.0%；料液比：1:10、1:20、1:30、1:40、1:50；乙醇濃度：30%、40%、50%、60%、70%；提取溫度：35℃、40℃、45℃、50℃、55℃；提取時(shí)間：10min、20min、30min、40min、50min；超聲功率：90W、132W、174W、216W、258W、300W。

（5）響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)Box-Behnken中心組合原理，在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，選擇酶添加量、乙醇濃度、提取時(shí)間和提取溫度四個(gè)因素為自變量，每一自變量的試驗(yàn)分別以-1、0、1編碼，以總黃酮提取率（%）為響應(yīng)值，進(jìn)行四因素三水平實(shí)驗(yàn)，利用Design-Expert8.05軟件對(duì)試驗(yàn)多元線性回歸和二項(xiàng)式擬合，并對(duì)擬合方程進(jìn)行方差分析。因素水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

二、結(jié)果與分析

1、酶制劑的篩選

不同酶制劑在不同pH條件下，所得總黃酮提取率也不相同。隨著pH的增加，在各種酶制劑作用下，阿爾泰金蓮花總黃酮提取率均呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)。從圖1可以看出，纖維酶在pH等于4時(shí)作用最好，其提取率可以達(dá)到17.09%，大于中性蛋白酶、半纖維素酶、果膠酶、無(wú)酶作用下的提取率。原液的pH為6.5，因此從提取率考慮，改變?nèi)芤旱膒H為4，且選擇纖維素酶進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

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