目的基于血清藥物化學(xué)與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探究麝香通心滴丸治療冠心病的機制。方法采用HPLC-Q-TOF/MS聯(lián)用技術(shù)分析麝香通心滴丸的入血成分。條件為Hydro-ＲP C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，4μm);流動相0.4%甲酸乙腈-0.2%甲酸，梯度洗脫;體積流量1.3 mL/min;進(jìn)樣量10μL。利用PharmMapper服務(wù)器、GeneCards數(shù)據(jù)庫預(yù)測和篩選麝香通心滴丸入血成分治療冠心病的作用靶點，String數(shù)據(jù)庫繪制蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，Cytoscape軟件構(gòu)建成分-疾病-靶點網(wǎng)絡(luò)圖，借助David數(shù)據(jù)庫對靶點進(jìn)行GO分析和KEGG通路分析，使用Autodock Vina軟件對入血成分和核心靶點進(jìn)行分子對接。結(jié)果共得到8種入血成分，涉及134個交集靶點，可能通過ErbB signaling pathway、VEGF signaling pathway、PPAＲsignaling pathway等信號通路治療冠心病，且分子對接顯示入血成分與核心靶點結(jié)合性較好。結(jié)論麝香通心滴丸8種入血成分可能是其治療冠心病的物質(zhì)基礎(chǔ)，可為深入闡明該制劑作用機制提供一定的依據(jù)。

“血清藥物化學(xué)”這一理論最先由德國科學(xué)家格哈德·多馬克所提出，后來我國科學(xué)家王喜軍教授提出符合中醫(yī)藥理論的中藥血清藥物化學(xué)。中藥成分較為復(fù)雜，經(jīng)口服給藥后，普遍認(rèn)為發(fā)揮藥效的活性成分應(yīng)該是被吸收入血的成分。通過分析口服給藥后血中成分，可確定中藥在體內(nèi)直接起作用藥效成分。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)通過生物學(xué)網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點的連接和關(guān)系來分析藥物對疾病網(wǎng)絡(luò)的干預(yù)，從整體效應(yīng)角度預(yù)測藥物靶點，是闡明中藥復(fù)方作用機制的重要手段之一。近年來文獻(xiàn)報道的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究大多數(shù)是以各數(shù)據(jù)庫中成分的口服生物利用度為篩選指標(biāo)。然而多味中藥在組成復(fù)方后，其原本的一些成分在其它成分的協(xié)同作用下，會使其原本較低的生物利用度得到改善，并且更改相應(yīng)的藥物劑型也會提高其生物利用度。因此對于多成分的中藥復(fù)方制劑，僅靠數(shù)據(jù)庫中的口服生物利用度為篩選指標(biāo)，會導(dǎo)致靶點預(yù)測不夠精確。麝香通心滴丸為內(nèi)蒙古康恩貝藥業(yè)有限公司圣龍分公司已上市產(chǎn)品，收載于2015年版《中國藥典》一部，于2017年1月13日被列入國家中藥保護(hù)品種，全方包括麝香、蟾酥、人參莖葉總皂苷、丹參、人工牛黃、熊膽粉、冰片，該品種屬于心腦血管領(lǐng)域用藥。雖然臨床上治療冠心病療效顯著，但其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)并不明確。本文通過HPLC-Q-TOF/MS對麝香通心滴丸進(jìn)行血清藥物化學(xué)研究，并基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對入血成分治療冠心病的作用機制進(jìn)行研究，為深入闡明麝香通心滴丸作用機制提供一定的依據(jù)。

1材料

1.1儀器

1260高效液相色譜儀、6530 Q-TOF/MS四極桿飛行時間質(zhì)譜儀(美國安捷倫公司);高速冷凍離心機、渦旋振蕩器(美國賽默飛世爾科技公司);Sartorius BS210S十萬分之一電子天平(德國賽多利斯公司)。

1.2試劑與藥物

麝香通心滴丸(內(nèi)蒙古康恩貝有限公司圣龍分公司，批號180607)。蟾毒靈(批號111981-201501，純度99.2%)、熊去氧膽酸(批號110755-201704，純度99.4%)、脂蟾毒配基(批號110718-201809，純度98%)購自中國食品藥品檢定研究院;遠(yuǎn)華蟾毒精(批號PS010798，純度98%)、去乙酰華蟾毒精(批號PS010804，純度98%)購自成都普思生物科技股份有限公司;沙蟾毒精(批號5283，純度98%)、甘氨膽酸(批號6723，純度98%)購自上海詩丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司;牛磺膽酸(批號PST190801-061，純度98%)購自成都樂美天醫(yī)藥科技有限公司。乙腈(批號SHBK3440，色譜純)、甲醇(批號10958407824，色譜純)購自默克化工技術(shù)(上海)有限公司。

1.3動物

5只SPF級健康雄性SD大鼠，購自上海西普爾必凱實驗動物有限公司，生產(chǎn)許可證號SCXK(滬)2013-0016，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心代為飼養(yǎng)，使許可證號SYXK(浙)2013-0184，條件為溫度(22±1)℃，相對濕度50%～60%，12 h光照，通風(fēng)頻率15～20次/h。大鼠以標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，飲水自由，倫理審查決議編號ZSLL-2017-054。

2方法

2.1麝香通心滴丸入血成分分析

2.1.1麝香通心滴丸混懸液制備

取適量麝香通心滴丸粉研磨成粉末，加入適量0.5%羧甲基纖維素鈉溶液，調(diào)整質(zhì)量濃度為0.4 g/mL，即得，搖勻備用。

2.1.2動物給藥與血清樣品采集

SD大鼠給藥前禁食12 h，自由飲水，以6.4 g/kg劑量給藥。給藥前采集空白血樣，在給藥15、30、45、60 min后眼眶取血各約0.5 mL，收集至EP管中靜置30 min，室溫下以3 000 r/min離心10 min，取上層血清，備用。

2.1.3血清樣本處理

分別精密吸取200μL空白血清和含藥血清(將“2.1.2”項下4個時間點含藥血清各吸取50μL混勻)于1.5 mL EP管內(nèi)，加入5倍量甲醇渦旋5 min，離心(4℃、10 000 r/min)10 min，上清液于常溫下氮氣吹干，100μL甲醇復(fù)溶，渦旋5 min，離心(4℃、10 000 r/min)5 min，取上清液供MS分析。

2.1.4色譜條件

Hydro-ＲP C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，4μm);流動相0.4%甲酸乙腈(A)-0.2%甲酸水(B)，梯度洗脫(0～5 min，5%A;5～13 min，5～20%A;13～40 min，20～22%A;40～60 min，22～45%A;60～75 min，45～75 A%);柱溫30℃;體積流量1.3 mL/min;進(jìn)樣量10μL。

2.1.5質(zhì)譜條件

離子源ESI，掃描方式ESI+、ESI-模式;干燥氣體溫度320℃，體積流量10 L/min;鞘氣溫度350℃，體積流量12 L/min;碎裂能量175 V;毛細(xì)管電壓3 kV;正負(fù)離子采集范圍m/z 50～1 500。

2.2網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

2.2.1預(yù)測潛在靶點

將分析得到的麝香通心滴丸入血成分通過PubChem數(shù)據(jù)庫得到其mol2格式文件，并將其上傳至PharmMapper服務(wù)器(限定靶蛋白為人類，其余為默認(rèn)選項)，采用“藥效團(tuán)匹配方法”得到虛擬篩選結(jié)果。將篩選出的分子-靶點匹配度(Fit Score)大于等于3的藥物靶點作為靶蛋白，并通過UniProt數(shù)據(jù)庫輸入篩選得到的蛋白靶點PDBID，經(jīng)檢索和轉(zhuǎn)化操作得到的麝香通心滴丸入血成分的潛在作用靶點。通過GeneCards數(shù)據(jù)庫，以“coronary atherosclerotic heart disease”為關(guān)鍵詞，檢索與冠心病相關(guān)的基因，并與上述成分靶點匹配進(jìn)行分析，篩選與麝香通心滴丸入血成分相關(guān)的作用靶點。

2.2.2蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

String數(shù)據(jù)庫是一種包含已知和預(yù)測蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用的數(shù)據(jù)庫，將上述成分-疾病交集靶點導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫，限定物種為人類(Homo sapiens)，最低相互作用閥值設(shè)為高等置信度0.9“highest confidence”，同時顯示設(shè)置隱藏游離點，然后下載PPI圖形件并保存tsv文件，最后使用Ｒ語言對得到的PPI進(jìn)行核心基因的篩選，其余參數(shù)保持默認(rèn)設(shè)置。

2.2.3靶標(biāo)GO富集分析和KEGG通路富集分析

本研究通過David 6.7數(shù)據(jù)庫，對成分-疾病交集靶點蛋白進(jìn)行GO富集分析、KEGG通路富集分析，其中GO富集分析包括生物過程(biological process)、分子功能(molecularfunction)和細(xì)胞組分(cellular component)3個部分，Select Identifier設(shè)置為Official GeneSymbol，List Type設(shè)置為Gene List，限定物種為人，并用FDＲ錯誤控制法對P值作檢驗校正，最終以“P＜0.05”作為條件進(jìn)行篩選，篩選出具有顯著差異的代謝通路。

2.2.4入血成分與核心靶點的分子對接

對上述麝香通心滴丸的入血成分與核心靶基因進(jìn)行分子對接，首先通過PubChem數(shù)據(jù)庫得到各分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)式。在PDB數(shù)據(jù)庫檢索靶基因蛋白構(gòu)象，并根據(jù)以下條件篩選:通過X晶體衍射法獲取的蛋白結(jié)構(gòu);蛋白的晶體解析度小于3;分型明確的蛋白。然后，使用AutoTools對蛋白進(jìn)行加氫去除水分子預(yù)處理，AutoGrid進(jìn)行能量格點計算，AutodockVina進(jìn)行小分子與蛋白對接，對每個對接進(jìn)行結(jié)合能(affinity)評分，PyMoL作活性分子和蛋白的互相作用圖。

聲明：本文所用圖片、文字來源《中成藥》2020年10月，版權(quán)歸原作者所有。如涉及作品內(nèi)容、版權(quán)等問題，請與本網(wǎng)聯(lián)系

相關(guān)鏈接：甲酸，蟾酥，羧甲基纖維素，晶體