仙草，又名涼粉草、仙人草，為唇形科涼粉草，屬一年生草本植物。在國(guó)內(nèi)主要產(chǎn)于廣東、福建、廣西、江西、云南等省份。國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃委員會(huì)在2010年3月發(fā)布[2010年]第3號(hào)公告，允許仙草作為普通食品生產(chǎn)經(jīng)營(yíng)，仙草被列入了中國(guó)食同源植物目錄。

仙草作為重要的藥用和食用植物資源，含有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分，仙草全草干樣含有約70％碳水化合物，少量蛋白質(zhì)、脂肪、色素等，還含有較多的礦物質(zhì)元素，是一種重要的藥食兩用的植物資源。在本草中記載仙草的藥用功效廣泛，具有治療腎臟病、糖尿病、關(guān)節(jié)肌肉疼痛、淋病，清暑、解熱利水、消渴、降血壓，抗衰老、抗癌等功能。是天然、安全、保健、營(yíng)養(yǎng)食品較理想的原料，其加工利用價(jià)值也非常廣泛，例如龜苓膏、仙草奶茶/涼茶、食用涼粉果膠等以仙草粉為主料，加多寶等涼茶飲料和其他一些牌子酸奶等飲料配表中也見(jiàn)含有仙草粉，對(duì)仙草粉的研究應(yīng)用已成為熱點(diǎn)。產(chǎn)品在東南亞國(guó)家及地區(qū)很受歡迎。

近兩年，國(guó)內(nèi)出口的仙草加工食品中，檢出了苯甲酸類(lèi)物質(zhì)，在國(guó)際經(jīng)濟(jì)形勢(shì)下滑，出口低迷，國(guó)外對(duì)輸入的產(chǎn)品控制越來(lái)越嚴(yán)格，有些國(guó)家及地區(qū)規(guī)定不能在該產(chǎn)品中添加苯甲酸類(lèi)防腐劑，對(duì)生產(chǎn)企業(yè)的出口貿(mào)易造成了較大的影響。苯甲酸和山梨酸是食品工業(yè)中常用的防腐劑，能有效防止酵母、霉菌、細(xì)菌的生長(zhǎng)。我國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB2760—2014中明確規(guī)定了苯甲酸的最大使用限量。

目前，苯甲酸的檢測(cè)方法有食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB5009.28—2016，兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)均為液相色譜法。王海華等、鄭玲等、何日安等均研究過(guò)液相色譜測(cè)定仙草中苯甲酸類(lèi)物質(zhì)。由于單純的色譜法只通過(guò)保留時(shí)間進(jìn)行定性，專(zhuān)屬性和特異性較差，易產(chǎn)生假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果，有文獻(xiàn)報(bào)道采用色譜質(zhì)譜聯(lián)用法檢測(cè)飲料和調(diào)味料中的苯甲酸。尚未發(fā)現(xiàn)國(guó)內(nèi)外關(guān)于使用高效液相色譜～質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定仙草中苯甲酸的文章和報(bào)道。本文利用液液萃取法提取仙草中、仙草產(chǎn)品中的苯甲酸，利用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM），可以對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行準(zhǔn)確定性定量，結(jié)果滿(mǎn)意。

一、實(shí)驗(yàn)部分

1、儀器與試劑

高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀LcMs8040，配電噴霧離子源（EsI）（日本島津公司）；超純水儀：Sanorius-comfort-I-8-TOc（德國(guó)賽多利斯公司）；振蕩儀YAMATOSA300（日本YamatoScientificCo，Ltd）。苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)品（GBw（E）0822621000μg/mL）（北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司）；乙酸銨：GR級(jí)（天津大茂）；乙腈：HPLc級(jí)（美國(guó)默克）；其他試劑為分析純?cè)噭?/p>

2、儀器條件

（1）色譜條件色譜柱

Shim-packGIST2.0mmI．D×150mmL，2.0μm；流動(dòng)相A：0.2mmol/L乙酸銨水溶液，B：乙腈，等度洗脫（A/B=70/30）；流速（0.4mL/min）；柱溫：40℃。進(jìn)樣量10μL。

（2）質(zhì)譜條件離子化模式

ESI（一）；離子噴霧電壓：4.5kV；霧化氣：氮?dú)?.0L/min；干燥氣：氮?dú)?5L/min；碰撞氣：氬氣；DL溫度：250℃；加熱模塊溫度：400℃；掃描模式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；駐留時(shí)間：20ms；延遲時(shí)間：3ms；MRM參數(shù)：見(jiàn)表1。

3、標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)溶液1000mg/L，用流動(dòng)相稀釋得到0.00、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0mg/L濃度點(diǎn)。

4、樣品前處理

稱(chēng)取樣品1～29，置于50mL聚四氟乙烯離心管中，加入1.0mL鹽酸溶液（1∶1）酸化，加入氯化鈉1g，分別用20mL、10mL乙醚提取兩次，每次振搖10min，將上層乙醚提取液吸出放另一離心管中，合并兩次乙醚提取液。提取液過(guò)無(wú)水硫酸鈉（馬輻爐450℃燒4h），用5mL乙醚淋洗，收集乙醚，40℃氮?dú)馑〈蹈?，加?mL流動(dòng)相蝸旋溶解，過(guò)0.22um濾膜備用。

5、樣品的測(cè)定

按Shim-packGIST2.0mmI．D×150mmL，2.0μm；流動(dòng)相A：0.2mmol/L乙酸銨水溶液，B：乙腈，等度洗脫（A/B=70/30）；流速（0.4mL/min）；柱溫：40℃。進(jìn)樣量10μL對(duì)標(biāo)準(zhǔn)系列溶液及提取凈化樣品進(jìn)行測(cè)試，外標(biāo)法定量。

二、結(jié)果與討論

1、色譜條件的選擇

采用液相色串聯(lián)譜質(zhì)譜法檢測(cè)苯甲酸，實(shí)驗(yàn)室參考國(guó)標(biāo)GB/T23495—2009方法，分離的色譜柱選用C18進(jìn)行分析（2.1μm，2.1×150mm）。離子化模式：ESl（一），選擇水-乙腈作為流動(dòng)相，實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)，苯甲酸出現(xiàn)峰展寬及拖尾現(xiàn)象，這是由于苯甲酸帶有與弱極性基團(tuán)，而C18色譜柱帶有硅羥基結(jié)構(gòu)，而硅羥基與苯甲酸上的羥基發(fā)生弱離子交換作用，導(dǎo)致峰展寬。Horiyama等通過(guò)在流動(dòng)相中加人緩沖鹽來(lái)改善分離效果。王祖翔等通過(guò)在流動(dòng)相中加人0.2mmol/L乙酸銨可以明顯改善分離效果，本實(shí)驗(yàn)室參照該條件，配置0.2mm01/L乙酸銨和乙腈作為流動(dòng)相，由于分析單物質(zhì)，本研究使用等度洗脫，配制濃度為1mg/L點(diǎn)，流動(dòng)相比例（0.2mmol/L乙酸銨/乙腈（v/v））：（90/10）、（85/15）、（80，20）、（70/30）的比例進(jìn)行洗脫，從峰形、響應(yīng)、保留時(shí)間分析，（70/30）配比可以達(dá)到較好的結(jié)果，不同流動(dòng)相配比對(duì)峰型的影響見(jiàn)圖1～4。
 

2、質(zhì)譜條件的優(yōu)化

配制苯甲酸濃度為1mg/L，在Q3scan掃描模式下，同時(shí)進(jìn)行正離子模式和負(fù)離子模式采集，試驗(yàn)結(jié)果表明：負(fù)離子模式獲得較強(qiáng)的準(zhǔn)分子離子信號(hào)，干擾相對(duì)較少。這與苯甲酸分子結(jié)構(gòu)有關(guān)，苯甲酸有羧酸結(jié)構(gòu)，易電離生成羧基，從而在負(fù)模式下更容易得到較強(qiáng)的準(zhǔn)分子離子，因此實(shí)驗(yàn)室選擇了負(fù)離子模式。通過(guò)直接進(jìn)樣標(biāo)準(zhǔn)溶液，質(zhì)譜自動(dòng)優(yōu)化得到苯甲酸：定量離子對(duì)為121.0/77.0。

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