近年來，醬香型白酒以其獨特的感官風味和更為舒適的飲后體征感受，越來越受到消費者的青睞。醬香型白酒的酒體中包含了種類更為豐富的風味物質(zhì)和生物活性組分，如四甲基吡嗪（tetramethylpyrazine，TTMP），近年來受到廣泛的關(guān)注，被認為是與醬香風格密切相關(guān)的物質(zhì)，同時也是行業(yè)中公認的“健康因子”，具有增加腦血管的血流量，減少腦缺血性疾病的發(fā)作、改善學習的障礙、防止由無水乙醇引起的胃粘膜損傷和腎中毒、防止由硫代乙酰胺引起的急性肝中毒、降低腦萎縮的傷害、防止肝纖維化等功效、分解甘油三酯、改善高血糖、抑制α-葡萄糖苷酶活性，同時具有體外抗炎作用等諸多健康功效。

隨著“健康中國”發(fā)展戰(zhàn)略的制定和實施，消費者對于飲酒的態(tài)度越來越理性，對于白酒健康層面的需求越來越強烈。由于醬香型白酒的獨特工藝特點，健康因子———四甲基吡嗪，仍然是研究的熱點。中國工程院孫寶國院士提出“白酒的發(fā)展方向是健康，健康白酒應該通過‘內(nèi)尋外加，自然強化’來實現(xiàn)”。在實際釀酒生產(chǎn)過程中，從制曲、堆積或發(fā)酵階段篩選出高產(chǎn)四甲基吡嗪的微生物，并應用強化到特定的生產(chǎn)發(fā)酵階段，這種方式是常見的高產(chǎn)四甲基吡嗪的手段。王西等將從高溫大曲中篩選得到的產(chǎn)香枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）應用到醬香型白酒生產(chǎn)中，結(jié)果顯示堆積組發(fā)酵后的糟醅中四甲基吡嗪相對含量達到6.98 μg/g，是空白組的4.56倍；王曉丹等將篩選得到的一株地衣芽孢桿菌（Bacilluslicheniformis）強化到粹沙工藝醬香白酒發(fā)酵的酒醅中，發(fā)酵后酒醅中的四甲基吡嗪含量是對照組的3.03倍。

以往的研究，僅應用菌種強化發(fā)酵的單一手段來提高基酒中的四甲基吡嗪含量。本研究針對醬香型白酒生產(chǎn)企業(yè)的實際生產(chǎn)工藝，對比了3種方法對醬香型白酒基酒中四甲基吡嗪的含量的影響，即利用菌種強化的方式，在釀酒發(fā)酵階段，通過功能微生物代謝提高基酒中四甲基吡嗪的含量；利用工藝優(yōu)化方式，將菌劑加入尾酒中浸提得到高含量四甲基吡嗪的浸提液，在烤酒階段，通過蒸餾方式（浸提液加入地鍋串蒸）使四甲基吡嗪遷移入基酒中；應用菌種強化和工藝優(yōu)化雙管齊下的方法。旨在為進一步提高醬香型白酒基酒中四甲基吡嗪的含量提供一種新的、可被企業(yè)實際應用的方法和思路。 

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種和曲粉

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）M2（MBJ09001）：分離自茅臺鎮(zhèn)某酒廠高溫大曲，保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心，菌種保藏編號為CGMCC 18734。曲粉：貴州國臺酒業(yè)五輪次釀酒生產(chǎn)時期的生產(chǎn)用曲粉。

1.1.2 試劑

小麥：某酒廠提供；四甲基吡嗪（色譜純）：上海麥克林生化科技有限公司；2-乙?；拎ぃㄉV純）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；氯化鈉（分析純）：天津市匯杭化工科技有限公司；無水乙醇（分析純）：天津市康科德科技有限公司；甲酸（色譜純）：美國Fluka公司；甲醇（色譜純）：德國默克公司；蛋白胨、酵母浸粉、瓊脂粉（均為生化試劑）：北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司；2-乙基丁酸（色譜純）：天津市光復精細化工研究所。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB液體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，酵母膏5 g，NaCl 10 g，蒸餾水1 000 mL，調(diào)pH=7.5，121 ℃高壓滅菌20 min。LB固體培養(yǎng)基：在LB液體培養(yǎng)基中添加瓊脂粉 15 g。

1.2 儀器與設(shè)備

BPS-250HC高溫培養(yǎng)箱：上海申騁儀器科技有限公司；Q-Trap 5500三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用（high performance liquidchromatography-mass spectrometry，HPLC-MS）儀：美國ABSCIEX公司；UFLC超高效液相系統(tǒng)：島津（上海）實驗器材有限公司；DGG-101-1BS電熱鼓風干燥箱：天津市天宇實驗儀器有限公司；DK-S26電熱恒溫水浴鍋：上海森信實驗儀器有限公司；LMQ.C-80E立式滅菌器：山東新華醫(yī)療器械股份有限公司；IT-09A5磁力攪拌器：上海一恒科學儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 高產(chǎn)四甲基吡嗪菌劑的制備

菌種活化：從甘油管保存的枯草芽孢桿菌M2中挑取少許菌體，在LB固體培養(yǎng)基平板上劃線，37 ℃培養(yǎng)18 h，長出單菌落后挑取單菌落再次劃線，以此重復三次，對菌株進行活化和純化。一級種子液：從活化后的枯草芽孢桿菌M2平板挑取少許單菌落菌體接種于LB液體培養(yǎng)基，裝液量15 mL/150 mL，37 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)至生長穩(wěn)定期。二級種子液：將一級種子液按10%（V/V）的接種量接于LB液體培養(yǎng)基，裝液量150 mL/250 mL，37 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)至生長穩(wěn)定期。固體菌劑制備：稱取麥沙（從酒廠制曲車間取得，與實際制曲生產(chǎn)時粉碎度相同的磨碎的小麥，已加水，但未添加母曲）和麥粉（用粉碎機粉碎的小麥粉），裝入不銹鋼盆中，每個不銹鋼盆中麥粉和麥沙按質(zhì)量比1∶1混勻。每盆3 kg原料中加入300 mL二級種子液（接種量為10%）和750 mL水，最終水分含量為37.1%。不銹鋼盆上覆蓋紗布，放入高溫培養(yǎng)箱中進行固體培養(yǎng)。培養(yǎng)期間，第1天在培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)24 h；第2天將培養(yǎng)溫度調(diào)整至44 ℃，持續(xù)1 d；發(fā)酵第3天將培養(yǎng)溫度調(diào)整至52 ℃，高溫生香保持2 d；以此條件循環(huán)兩次制備得到固體菌劑。發(fā)酵過程中觀察發(fā)酵情況，每天根據(jù)濕度補水、攪拌、測量溫度。

1.3.2 高產(chǎn)四甲基吡嗪菌劑的生產(chǎn)應用方式

菌種強化方式：將制備得到的菌劑自然干燥后再進行磨粉，應用于2019年貴州國臺酒業(yè)五輪次基酒的生產(chǎn)中，選取了三車間9班8號窖池作為實驗窖池，另選擇該班組其他4個窖池作為對照窖池。應用功能枯草芽孢桿菌M2制作的固態(tài)菌劑（干燥粉碎后）（共10 kg）強化到醬香型白酒堆積發(fā)酵結(jié)束后、入窖發(fā)酵之前窖池的上層糟醅中，菌劑與普通曲粉的質(zhì)量比為1∶5，跟蹤發(fā)酵生產(chǎn)進程，經(jīng)過一個輪次的發(fā)酵后（30 d），開窖烤取基酒，評定基酒中四甲基吡嗪的含量和感官質(zhì)量的差異。

工藝優(yōu)化方式：將制備得到的高含量四甲基吡嗪的菌劑，按照1∶10的質(zhì)量比添加到醬香型白酒基酒生產(chǎn)過程產(chǎn)生的頭尾酒中，浸泡7 d，獲得頭尾酒浸提液，再將頭尾酒浸提液替代普通頭尾酒，倒回地鍋，通過蒸餾烤酒使得浸提液中的四甲基吡嗪遷移至基酒中，評定基酒中四甲基吡嗪的含量和感官質(zhì)量的差異。

菌種強化結(jié)合工藝優(yōu)化方式：應用上述菌種強化和工藝優(yōu)化相結(jié)合的方式，即在釀酒生產(chǎn)階段進行菌種強化，在蒸餾烤酒階段進行工藝優(yōu)化。在2019年貴州國臺酒業(yè)六輪次基酒的生產(chǎn)過程中，選取了一車間1班6號窖池作為實驗窖池，該班組其他窖池均為對照窖池。評定基酒中四甲吡嗪的含量和感官質(zhì)量的差異。

1.3.3 分析檢測方法

（1）四甲基吡嗪的檢測方法曲粉/菌劑樣品前處理：稱取2.8 g粉碎后的曲粉/菌劑樣品，加入20 mL體積分數(shù)為53%的乙醇溶液，浸泡10 min，25 ℃條件下超聲提取30 min，超聲功率250 W，超聲頻率40 kHz，20 ℃、8 000 r/min條件下離心10 min，收集上清液，稀釋至合適倍數(shù)后過0.45 μm的有機濾膜，取過濾后樣品1 mL于液相樣品瓶中，供液質(zhì)分析。基酒酒樣前處理：基酒酒樣稀釋至合適倍數(shù)后0.45μm的有機濾膜，取過濾后樣品1 mL于液相樣品瓶中，供液質(zhì)分析。

采用HPLC-MS檢測四甲基吡嗪含量，參考以往文獻報道的方法進行優(yōu)化[18-21]，液相色譜條件ACQUITY UPLCBEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），柱溫35 ℃；流動相為甲醇：0.1%甲酸=35∶65（V/V）；流速0.4 mL/min；洗脫梯度：0.01～1 min，10%甲醇；1～5 min，35%甲醇。質(zhì)譜條件：多反應監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM）模式，具體參數(shù)見表1。

正離子模式下，以四甲基吡嗪標準品的保留時間、精確質(zhì)量數(shù)匹配，結(jié)合二級特征碎片離子，實現(xiàn)定性分析。采用外標法進行四甲基吡嗪的定量分析。 

（2）理化指標檢測方法菌劑和大曲的酸度測定采用酸堿滴定法，糖化力采用菲林滴定法，具體檢測方法參見《白酒生產(chǎn)技術(shù)全書》。 

（3）基酒感官品評方法組織4位國家一級品酒師，對本研究中的基酒樣品進行感官品評，分別從曲香、醬香、酒體醇和度、后味、干凈度這5個維度進行打分評價（0～9分，0代表感知不到，9代表特征極為明顯）。

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