4、突變株遺傳穩(wěn)定性驗(yàn)證

由圖3可知，隨著傳代次數(shù)的增多，突變株NCU—A38、NCU—A17出現(xiàn)了一定程度的衰退，產(chǎn)酶能力有所下降，集中出現(xiàn)在傳代6次以后，最終在第九代分別下降至696.4 U/g、661.2U/g，下降幅度分別為8.3％、7.7％；而突變株NCU—A55和原始菌株經(jīng)過9代傳代培養(yǎng)后，中性蛋白酶活分別為739.0U/g ，604.0U／g，僅下降0.4％、0.6％，下降幅度較小，遺傳穩(wěn)定性良好。綜合考慮突變株產(chǎn)中性蛋白酶活力及遺傳穩(wěn)定性，選取突變株NCU—A55進(jìn)行后續(xù)研究。
 

5、突變株NCU—A55與原始菌株生長性能及產(chǎn)蛋白酶系活力對(duì)比

（1）突變株NCU—A55與原始菌株形態(tài)觀察

ARTP對(duì)微生物遺傳物質(zhì)造成高度損傷，能在短時(shí)間構(gòu)建大容量突變庫，其遺傳物質(zhì)的改變一般會(huì)體現(xiàn)在表型上。如圖4所示，原始菌株經(jīng)ARTP誘變后，其菌落形態(tài)發(fā)生了非常明顯的變化。誘變前，菌落中間凸起，菌落中心孢子分布稀疏，為淡黃色；誘變后的菌落大而平坦，菌落中心孢子分布飽滿，呈黃綠色，顯示出突變菌株具有更快的生長速度。而從圖5可以看出，高倍顯微鏡下觀察到突變株NCU A55菌絲的分化枝點(diǎn)相對(duì)原始菌株更多，菌絲繁殖能力更強(qiáng)；低倍顯微鏡下觀察到突變株NCU—A55菌絲的分生孢子頭比原始菌株較多且更密集，產(chǎn)孢子能力更強(qiáng)。這與司曉光研究結(jié)果較為一致，其采用AIHP誘變技術(shù)選育得到一株高產(chǎn)酸性蛋白酶的突變株B一2，菌絲較原始菌株短，分生孢子頭多，產(chǎn)孢子較快，在固態(tài)發(fā)酵過程中突變株B一2的生長速率明顯優(yōu)于出原始菌株。Veerana等人報(bào)道，熱效應(yīng)常壓等離子體誘變通過刺激孢子溶脹、細(xì)胞膜去極化、激活鈣和一些萌發(fā)相關(guān)基因，促進(jìn)了米曲霉孢子萌發(fā)能力的增強(qiáng)。由此看來，突變株生長速度加快，產(chǎn)孢子增多的有利表型不一定是因?yàn)锳RTP作用于細(xì)胞核酸水平的分子結(jié)構(gòu)而引起菌體遺傳物質(zhì)的改變，進(jìn)而影響突變株的生長代謝；也有可能是由于ARTP作用改變質(zhì)膜通透性，使得細(xì)胞基質(zhì)產(chǎn)生大量活性氧等成分進(jìn)入細(xì)胞，與生物大分子相互作用，從而改變大分子構(gòu)象及活性，進(jìn)而導(dǎo)致突變株代謝途徑的改變，并有可能會(huì)影響到菌體產(chǎn)蛋白酶能力。

（2）突變株NCU—A55與原始菌株產(chǎn)孢子能力對(duì)比

如圖6所示，突變株NCU—A55與原始菌株種曲培養(yǎng)基上的產(chǎn)孢子量在60h前并無顯著性差異，但在72～84h時(shí)，突變株NCU—A55產(chǎn)孢子量顯著高于原始菌株（P＜0.05），并在72h時(shí)，突變株NCU—A55孢子量達(dá)到10.25×109CFU/g，較原始菌株提高了39.3％，并達(dá)到企業(yè)對(duì)種曲的使用要求?；谕蛔冎昱c原始菌株形態(tài)對(duì)比的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步證實(shí)了突變株NCU—A55產(chǎn)生了有利的表型，其產(chǎn)孢子能力較原始菌株顯著增強(qiáng)，有研究表明產(chǎn)孢子能力增強(qiáng)有利于促進(jìn)蛋白酶的分泌。曹曉梅采用ARTP結(jié)合化學(xué)誘變手段選育高產(chǎn)阿維菌素的突變株也得到了類似的結(jié)果，正突變菌株表現(xiàn)為褶皺多，孢子豐滿，且與目標(biāo)產(chǎn)物呈正相關(guān)。

（3）蛋白酶系對(duì)比

由圖7a可知，突變株NCU—A55與原始菌株的中性蛋白酶活力制曲60h前并無顯著性差異，在60～84h時(shí)，突變株的中性蛋白酶活力顯著高于原始菌株，并在60h突變株的中性蛋白酶活力最高，達(dá)到958.8U/g，較原始菌株酶活力提升了14.7％；由圖7b和7c可知，突變株堿性蛋白酶活力和酸性蛋白酶活力最大值分別出現(xiàn)在制曲60h、72h，達(dá)到435.9U/g、109.1U/g，比原始菌株下降13.5％、提升了14.2％。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與曹小琴利用低能N+離子束注入技術(shù)選育醬油釀造用菌米曲霉結(jié)果較為一致，其選育的米曲霉突變株蛋白酶活力比原始菌株提高了36％，而本實(shí)驗(yàn)中，采用新型的離子束注入技術(shù)，ARTP誘變?cè)季?，選育得到的米曲霉突變株其中性、酸性蛋白酶活力均顯著提升，其可能的原因是等離子體中的活性粒子作用于菌株細(xì)胞，導(dǎo)致菌株細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)及通透性發(fā)生改變并引起基因損傷，從而引起菌體一系列的生理變化，擴(kuò)大了該菌株自身對(duì)于碳氮比的需求，但有關(guān)堿性蛋白酶活性下降的原因還有待進(jìn)一步的研究。

三、結(jié)論

ARTP誘變米曲霉菌株NCU一110效果明顯，誘變選育得到突變株NCU—A55，淺盤制曲復(fù)篩實(shí)驗(yàn)證實(shí)其中性蛋白酶活力較原始菌株提升了21.0％，曲醅酶活力達(dá)到741.6U/g，遺傳穩(wěn)定性良好。蛋白酶系對(duì)比實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明突變株NCU—A55蛋白酶系以中性酶活力為主的特點(diǎn)，且蛋白酶系完整。在制曲60h時(shí)中性蛋白酶活力最高，達(dá)到958.8U／g，酶活力較初始菌株酶顯著提升14.7％；通過形態(tài)觀察及產(chǎn)孢子能力對(duì)比，發(fā)現(xiàn)突變株NCU A55具有菌絲生長速度快、產(chǎn)孢子能力顯著增強(qiáng)的有利表型。本試驗(yàn)為米曲霉菌種的改良提供了新思路，為曲霉型豆豉生產(chǎn)提供了一株生長速度快、產(chǎn)中性蛋白酶高活力的優(yōu)良菌種。后續(xù)實(shí)驗(yàn)可進(jìn)一步探究其高產(chǎn)中性蛋白酶的機(jī)理及對(duì)原料的利用效率和發(fā)酵豆豉的風(fēng)味、滋味特點(diǎn)。

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