基因毒性雜質(zhì)又稱遺傳毒性雜質(zhì)，在痕量下即可損傷人類的DNA，具有一定的致癌性和致突變性，嚴(yán)重威脅人類的健康。N-亞硝基二甲胺（NDMA）是一種常見的N-亞硝胺類化合物，多來源于消毒劑、添加劑等生產(chǎn)過程中的副產(chǎn)物，普遍存在于水、食品、煙草中，NDMA毒性強(qiáng)，具有致癌、致畸和致突變作用。自從纈沙坦中檢測(cè)出N-亞硝胺類基因毒性雜質(zhì)后，為保證藥品的質(zhì)量和安全性，N-亞硝胺類基因毒性雜質(zhì)的檢測(cè)便備受國內(nèi)外藥監(jiān)部門的關(guān)注。近年來，企業(yè)對(duì)藥品中基因毒性雜質(zhì)的控制越來越嚴(yán)格，檢測(cè)藥品中N亞硝胺類基因毒性雜質(zhì)的研究方法逐漸增多，如高效液相色譜法、氣相色譜法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法和氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法等。
二甲雙胍格列本脲片（I）是口服的復(fù)方降糖藥，其療效好、用量少、副作用低，主治經(jīng)飲食控制、運(yùn)動(dòng)和服用二甲雙胍或者磺脲類藥物仍未不能控制血糖的Ⅱ型糖尿病。目前，僅見鹽酸二甲雙胍緩釋片中N-亞硝胺類基因毒性雜質(zhì)檢測(cè)的報(bào)道，而二甲雙胍格列本脲片（I）中NDMA的檢測(cè)至今尚未見報(bào)道。為確保藥品質(zhì)量及其應(yīng)用的安全，應(yīng)嚴(yán)格控制藥品中的基因毒性雜質(zhì)。筆者建立了檢測(cè)二甲雙胍格列本脲片（I）中基因毒性雜質(zhì)NDMA的高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法，為藥品的質(zhì)量控制提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)：LC-30AD型高效液相色譜儀，日本島津公司。質(zhì)譜儀：TripleQuad6500型，美國ABSCIEX公司。電子天平：XS105型，感量為0.01mg，瑞士梅特勒-托利多公司。N-亞硝基二甲胺對(duì)照品：含量為99.9%，批號(hào)為1681903，美國TMstandard公司。二甲雙胍格列本脲片（I）：批號(hào)分別為2011030304、2011040304、2011020304，市售。甲醇、甲酸：色譜純，賽默飛世爾科技中國有限公司。實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 溶液的配制

N-亞硝基二甲胺對(duì)照品儲(chǔ)備溶液：精密稱定N亞硝基二甲胺對(duì)照品25mg，置于25mL容量瓶中，加適量甲醇溶液使其溶解，并稀釋至標(biāo)線，搖勻，制成質(zhì)量濃度為1mg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。分析前用甲醇稀釋成所需濃度。

樣品溶液：取二甲雙胍格列本脲片（I）20片，研細(xì)，精密稱取細(xì)粉500mg，置于10mL容量瓶中，加入適量甲醇溶液振搖使其溶解，用水定容至標(biāo)線，搖勻，即得。

1.3 儀器工作條件

1.3.1 色譜條件

色譜柱：ACEC18-HL色譜柱（150mm×4.6mm，5μm，廣州菲羅門科學(xué)儀器有限公司）；柱溫：40℃；流動(dòng)相：A相為0.1%甲酸-水溶液，B相為甲醇；梯度洗脫：洗脫程序列于表1，流量為0.6mL/min；進(jìn)樣體積：5μL。

1.3.2 質(zhì)譜條件

離子源：大氣壓化學(xué)電離源（APCI源）；檢測(cè)模式：正離子模式檢測(cè)；掃描模式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）；離子源溫度（TEM）：350℃；脫溶劑氣流量：35mL/min；NC電流：3μA；氣簾氣（CUR）：206.8kPa；霧化氣（GS1）壓力：241.3kPa。

2 結(jié)果與討論

2.1 溶劑的選擇

二甲雙胍格列本脲片（I）中含有輔料羥丙甲纖維素，其溶于水及大多數(shù)極性溶劑，然而羥丙甲纖維素在水中會(huì)溶脹成澄清或微濁膠體溶液，嚴(yán)重影響鹽酸二甲雙胍的溶解性，故應(yīng)避免使用水作為溶劑。試驗(yàn)考察了甲醇、N，N-二甲基甲酰胺、N，N-二甲基亞砜、四氫呋喃、三氯甲烷和甲苯的溶解性和適用性，最終選擇甲醇作為溶劑。

2.2 耐用性考察

改變流量、柱溫、流動(dòng)相B的初始比例考察建立方法的耐用性。結(jié)果表明，微調(diào)流速、柱溫、流動(dòng)相B的初始比例后，基因毒性雜質(zhì)N-亞硝基二甲胺的測(cè)定值基本一致，說明該方法中的色譜條件耐用性良好。

2.3 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)

N-亞硝基二甲胺對(duì)照品溶液、樣品溶液和溶劑，按1.3.1色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，樣品溶液色譜圖見圖1，N-亞硝基二甲胺加標(biāo)色譜圖見圖2。由圖1、圖2可知，在該色譜條件下，N-亞硝基二甲胺色譜峰形較好，且溶劑不干擾測(cè)定，說明該方法的專屬性較好。

2.4 線性關(guān)系、檢出限與定量限

精密量取1.2對(duì)照品溶液0.1、0.2、0.5、1.0、5、10mL置于10mL容量瓶中，加甲醇稀釋至標(biāo)線，制成質(zhì)量濃度分別為1、2、5、10、50、100ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液。將上述溶液分別注入液相色譜-質(zhì)譜儀，按1.3.1色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，以N-亞硝基二甲胺對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），以色譜峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行線性回歸分析，計(jì)算得到線性回歸方程Y=75391X+44066，相關(guān)系數(shù)r=0.9998，N-亞硝基二甲胺的質(zhì)量濃度在1.0268～102.68ng/mL范圍內(nèi)與色譜峰面積線性關(guān)系良好。

1.2對(duì)照品溶液逐步稀釋成不同濃度，按1.3色譜條件進(jìn)樣分析，連續(xù)測(cè)定6次，記錄色譜圖，以信噪比S/N=3和S/N=10分別確定檢出限（LOD）和定量限（LOQ）。結(jié)果表明，N-亞硝基二甲胺的檢出限和定量限分別為0.0342ng/mL和0.10268ng/mL。

2.5 加標(biāo)回收試驗(yàn)

精密稱取樣品約100mg，共9份，置于10mL容量瓶中，加入甲醇溶解，再分別精密加入N-亞硝基二甲胺對(duì)照品溶液0.2、0.5、1.0mL各3份，加溶劑定容至標(biāo)線，搖勻。按1.3色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，計(jì)算加標(biāo)回收率，結(jié)果列于表2。由表2可知，N-亞硝基二甲胺的平均回收率為96.32%，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為8.5%，表明本法的回收率良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

1.2制備N-亞硝基二甲胺對(duì)照品溶液。稱取樣品溶液約100mg，精密稱定，置于10mL容量瓶中，加甲醇溶解，再精密加入N-亞硝基二甲胺對(duì)照品溶液0.2mL，加甲醇定容至標(biāo)線，搖勻，制備成N-亞硝基二甲胺加標(biāo)溶液。取室溫下放置0、1、2、3、6、10h后的對(duì)照品溶液和加標(biāo)樣品溶液，按1.3色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，以N-亞硝基二甲胺的色譜峰面積考察溶液穩(wěn)定性，結(jié)果列于表3。

由表3可知，N-亞硝基二甲胺對(duì)照品溶液色譜峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.3%，而加標(biāo)樣品溶液中色譜峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.7%，表明上述兩種溶液在10h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 樣品測(cè)定

取適量二甲雙胍格列本脲片（I）（批號(hào)分別為2011030304，2011040304，2011020304），按1.2配制樣品溶液，按1.3色譜條件分析，采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算含量。結(jié)果表明，3批二甲雙胍格列本脲片（I）中均未檢測(cè)出基因毒性雜質(zhì)N-亞硝基二甲胺。

3 結(jié)語

建立了高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法檢測(cè)二甲雙胍格列本脲片（I）中的基因毒性雜質(zhì)N-亞硝基二甲胺，該方法操作簡(jiǎn)便、靈敏、準(zhǔn)確、重復(fù)性好。可用于監(jiān)控二甲雙胍格列本脲片（I）中基因毒性雜質(zhì)的水平，不僅為其質(zhì)量控制提供參考，還能夠確保藥品的安全性，具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

相關(guān)鏈接：N-亞硝基二甲胺，二甲雙胍，甲醇，N-二甲基亞砜

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