大曲是山西酒、醋釀造中重要的發(fā)酵劑，在山西酒、醋的發(fā)酵過(guò)程中起著非常重要的作用，直接影響產(chǎn)品質(zhì)量和產(chǎn)量。大曲中的微生物利用原料底物生成大量不同種類的香味物質(zhì)或香味前體物。再經(jīng)過(guò)微生物的轉(zhuǎn)化及工序傳遞，賦予成品酒、醋豐富的滋味和良好的香氣，構(gòu)成傳統(tǒng)山西酒、醋特有的風(fēng)味。

大曲中的微生物種群主要包括霉菌、酵母菌和細(xì)菌3大類。霉菌是大曲中最主要的菌群，其代謝產(chǎn)生豐富的淀粉酶、糖化酶、蛋白酶等酶系，用于分解淀粉和蛋白質(zhì)原料產(chǎn)生多種有機(jī)酸、氨基酸、酯類等風(fēng)味物質(zhì)。酵母菌不僅利用糖生成大量乙醇和其它醇類物質(zhì)。同時(shí)還生成乳酸乙酯、乙酸乙酯、乙酸丁酯等多種酯類香氣物質(zhì)。大曲中的細(xì)菌則主要包括芽孢菌、乳酸菌和少量醋酸菌，眾多種類的細(xì)菌大大補(bǔ)充并豐富了霉菌的酶系，是產(chǎn)生有機(jī)酸、酯類、酮類、醛類等風(fēng)味物質(zhì)和酚、黃酮、乙偶姻等功能活性物質(zhì)的主要貢獻(xiàn)者。

近年來(lái)。一些學(xué)者對(duì)山西老陳醋大曲中的微生物進(jìn)行了分離。武晉海等采用傳統(tǒng)分離手段從陳醋大曲中分離到乳酸菌、芽孢菌和醋酸菌，并且發(fā)現(xiàn)醋酸菌主要分布在大曲表面。乳酸菌和芽孢菌則主要分布在大區(qū)內(nèi)部。馮峰采用傳統(tǒng)分離手段結(jié)合PCR-DGGE技術(shù)研究大曲制備過(guò)程，發(fā)現(xiàn)前期的優(yōu)勢(shì)菌主要為戊糖片球菌、彎曲乳桿菌及融合魏斯氏菌，中期優(yōu)勢(shì)菌主要為歐文氏菌；后期則主要是芽孢桿菌。

本文采用高通量測(cè)序技術(shù)研究山西老陳醋釀造用大曲的細(xì)菌群落多樣性，為揭示山西老陳醋微生物釀造機(jī)理，進(jìn)一步優(yōu)化大曲生產(chǎn)工藝，提高大曲質(zhì)量奠定基礎(chǔ)。該研究對(duì)于整個(gè)老陳醋行業(yè)的發(fā)展具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

在山西老陳醋東湖醋廠曲房中隨機(jī)選取3塊大曲置于滅菌的自封袋中，粉碎后混合保存于-80℃冰箱，備用。

1.2 主要試劑與設(shè)備

1.2.1 試劑

QIAquickPCRPurifieationKit，德國(guó)Qiagen公司；Tris-平衡酚，北京索萊寶科技有限公司；乙二胺四乙酸鈉，天津市恒興試劑有限公司。

1.2.2 設(shè)備

170-4406型水平電泳系統(tǒng)、Univer-sialHoodⅡ型凝膠成像系統(tǒng)、T100型PCR儀，美國(guó)Bio-Rad公司：5417R型高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司；anoDrop2000型微量紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì)，美國(guó)ThermoScientmc公司。

1.3 宏基因組提取

參考聶志強(qiáng)等提取醋醅宏基因組的方法。提取的宏基因組用微量紫外一可見(jiàn)光分光光度計(jì)進(jìn)行檢測(cè)，0D260/280值維持在1.8～2.0范圍內(nèi)，表明宏基因組質(zhì)量合格，可用于后續(xù)測(cè)序。

1.4 細(xì)菌DNA片段擴(kuò)增及Miseq文庫(kù)建立

以提取的宏基因組DNA為模板，加入細(xì)菌對(duì)應(yīng)區(qū)域特異性引物(515F：5’-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’和806R：5’-GGACTACHVGGGTWTCTAA-3’)、PCRMasterMix對(duì)細(xì)菌16SrD-NAV4區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物送至深圳華大基因進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建及測(cè)序，測(cè)序平臺(tái)為MiSeq2000。

1.5 系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

將測(cè)序得到的操作分類單元(0TU)序列在美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心采用基本局部比對(duì)搜索工具進(jìn)行比對(duì)，搜索與目的0TU序列同源性最高的序列，經(jīng)MEGA5.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 山西老陳醋大曲細(xì)菌群落多樣性分析

以山西老陳醋大曲宏基因組DNA為模板，利用特異性引物對(duì)細(xì)菌16SrDNAV4區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增，采用MiSeq2000測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。由表1可知，大曲樣品獲得36995個(gè)原始讀長(zhǎng)，濾除低質(zhì)量的數(shù)據(jù)后，剩余35116個(gè)高質(zhì)量讀長(zhǎng)。利用重疊關(guān)系將雙末端測(cè)序得到的成對(duì)讀長(zhǎng)拼接成32230個(gè)序列，平均長(zhǎng)度為(252±1)bp。拼接好的序列聚類為104個(gè)細(xì)菌OTU。最終，測(cè)序覆蓋度達(dá)到99.93％，說(shuō)明該測(cè)序量合理，可以進(jìn)行下一步分析。

α-多樣性通常用于分析單個(gè)樣本中微生物數(shù)量的豐度及微生物種類的多樣性，主要包括Chao指數(shù)、ACE指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)。通過(guò)Mothur(v1.31.2)軟件計(jì)算微生物群落“一多樣性指數(shù)期望值并用R(v3.1.1)軟件繪制相應(yīng)的細(xì)菌“一多樣性稀釋曲線。由圖1可知，測(cè)序量在10000bD以內(nèi)時(shí)，隨著測(cè)序量增加，山西老陳醋大曲細(xì)菌的Chao指數(shù)和ACE指數(shù)急劇增加，當(dāng)測(cè)序量增加到25000bp之后，Chao指數(shù)、ACE指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)都趨于平緩。

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