大腸埃希氏菌作為正常菌群而存在于人和動(dòng)物腸道中，并廣泛存在于自然界。大腸埃希氏菌的某些菌株對(duì)人有致病性。人和動(dòng)物的帶菌是傳播本菌引起食物中毒的重要原因。

致瀉大腸埃希菌(Eschrichia coli)，簡(jiǎn)稱致病性大腸菌。根據(jù)其致病機(jī)制可分為4個(gè)類型。腸道致病性大腸菌(Enteropathogenic E．coli，EPEC)，腸道侵襲性大腸菌(Enteroinvasive E．Coli,EIEC)，產(chǎn)腸毒素大腸菌(EntervtoxigencE．coli，ETEC)，腸道出血性大腸菌(Entero一hemorrhagic E．coli，EHEC)。EPEC主要引起新生兒的腹瀉。EPEC、ETEC引起腹瀉腹痛型胃腸炎。EIEC引起的胃腸炎酷似痢疾。EHEC引起出血性大腸炎。

一、檢驗(yàn)方法

檢樣主要為可疑食物、嘔吐物、糞便。糞便標(biāo)本盡可能在患者接受抗菌素治療前采集。樣品采集后，應(yīng)盡快檢驗(yàn)，除了易腐食品在檢驗(yàn)之前應(yīng)冷藏外，一般不冷藏。

(一)分離培養(yǎng)及生化鑒定

無(wú)菌稱取檢樣25g，加在225mL營(yíng)養(yǎng)肉湯中，均質(zhì)lmin。取出適量，接種乳糖膽鹽培養(yǎng)基，以測(cè)定大腸菌群MPN，其余的移入500 mL廣口瓶?jī)?nèi)，于36±1℃培養(yǎng)6h。挑取1環(huán)，接種于一管30mL腸道菌增菌肉湯內(nèi)，于42℃培養(yǎng)18h。

將乳糖發(fā)酵陽(yáng)性的乳糖膽鹽發(fā)酵管和增菌液分別劃線接種麥康凱或伊紅美藍(lán)瓊脂平板；污染嚴(yán)重的檢樣，可將檢樣勻液直接劃線接種麥康凱或伊紅美藍(lán)平板，于36±1℃培養(yǎng)18～24h，觀察菌落。不但要注意乳糖發(fā)酵的菌落，同時(shí)也要注意乳糖不發(fā)酵和遲緩發(fā)酵的菌落。

自鑒別平板上直接挑取數(shù)個(gè)菌落，分別接種三糖鐵瓊脂(TSI)或克氏雙糖鐵瓊脂(KI)。同時(shí)將這些培養(yǎng)物分別接種蛋白胨水、半固體、pH7.2尿素瓊脂、KCN肉湯和賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)培養(yǎng)基。以上培養(yǎng)物均在36℃培養(yǎng)過(guò)夜。

FSI斜面產(chǎn)酸或不產(chǎn)酸，底層產(chǎn)酸，H₂S陰性，KCN陰性和尿素陰性的培養(yǎng)物為大腸埃希氏菌。TSI底層不產(chǎn)酸，或H₂S、KCN、尿素有任一項(xiàng)為陽(yáng)性的培養(yǎng)物，均非大腸埃希氏菌。必要時(shí)做氧化酶試驗(yàn)和革藍(lán)氏染色。

(二)血清學(xué)試驗(yàn)

假定試驗(yàn)：挑取經(jīng)生化試驗(yàn)證實(shí)為大腸埃希氏菌的瓊脂培養(yǎng)物，用腸道致病性大腸埃希氏菌、腸道侵襲性大腸埃希氏菌和產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌多價(jià)O血清和腸道出血性大腸埃希氏菌0157血清作玻片凝集。當(dāng)與某一種多價(jià)O血清凝集時(shí)，再與該多價(jià)血清所包含的單價(jià)0血清作試驗(yàn)。致瀉大腸埃希氏菌所包括的0抗原群見(jiàn)表5—1。如與某一個(gè)單價(jià)O血清呈現(xiàn)強(qiáng)凝集反應(yīng)，即為假定試驗(yàn)陽(yáng)性。

證實(shí)試驗(yàn)：制備O抗原懸液，稀釋至與Mac Farland 3號(hào)比濁管相當(dāng)?shù)臐舛?。原效價(jià)為1:160-1:320的O血清，用0.5％鹽水稀釋至1:40。稀釋血清與抗原懸液在10mm×75mm試管中等量混合，做單管凝集試驗(yàn)。混勻后放于50⁰C水浴箱內(nèi)，經(jīng)16.h后觀察結(jié)果。如出現(xiàn)凝集，可證實(shí)為該0抗原。

(三)腸毒素試驗(yàn)

產(chǎn)毒培養(yǎng)：將試驗(yàn)菌株和陽(yáng)性及陰性對(duì)照菌株分別接種于0.6 mLCAYE培養(yǎng)基內(nèi)，37⁰C振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。加入20000IU／mL的多粘菌素B0.05mL，于37⁰C1h，以4000r/min離心15min，分離上清液，加入0.1％硫柳汞0.05mL，于4℃保存待用。

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)不耐熱的腸毒素(LT)(雙抗體夾心法)：

(1)包被：先在產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌LT和ST酶標(biāo)診斷試劑盒中取出包被用LT抗體管，加入包被液0.5mL，混勻后全部吸出于3.6mL包被液中混勻，以每孔100μL量加入到40孔聚苯乙烯硬反應(yīng)板中，第一孔留空作對(duì)照，于4⁰C冰箱濕盒中過(guò)夜。(2)洗板：將板中溶液甩去，用洗滌液I洗3次，甩盡液體，翻轉(zhuǎn)反應(yīng)板，在吸水紙上拍打，去盡孔中殘留液體。(3)封閉：每孔加100μL封閉液，于37⁰C水浴中1h。(4)洗板：用洗滌液Ⅱ洗3次，操作同上。(5)加樣本：每孔分別加各種試驗(yàn)菌株產(chǎn)毒培養(yǎng)液100μL，37⁰C水浴中1h。(6)洗板：用洗滌液Ⅱ洗3次，操作同上。(7)加酶標(biāo)抗體：先在酶標(biāo)I。T抗體管中加0.5mL稀釋液，混勻后全部吸出于3.6mL稀釋液中混勻，每孔加100μL，37⁰C水浴中1h。(8)洗板：用洗滌液Ⅱ洗3次，操作同上。(9)酶底物反應(yīng)：每孔(包括第一孔)各加基質(zhì)液100μL，室溫下避光作用5～10min，加入終止液50μL。(10)結(jié)果判定：以酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)492nm下測(cè)定吸光度OD值，待測(cè)標(biāo)本OD值大于陰性對(duì)照3倍以上者為陽(yáng)性。目測(cè)顏色為桔黃色或明顯高于陰性對(duì)照為陽(yáng)性。

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)耐熱腸毒素(ST)(抗原競(jìng)爭(zhēng)法)：(1)包被：先在包被用ST抗原管中加0.5mL包被液，混勻后部吸出于1.6mL包被液中混勻，以每孔50μL加入于40孔聚苯乙烯軟反應(yīng)板中。加液后輕輕敲板，使液體布滿孔底。第一孔留空作對(duì)照。置4℃冰箱濕盒中過(guò)夜。(2)洗板：用洗滌液I洗3次，操作同上，(3)封閉：每孔加封閉液100μL，37℃水浴lh。(4)洗板：用洗滌液Ⅱ洗3次，操作同上。(5)加樣本及ST單克隆抗體：每孔分別加各試驗(yàn)菌株產(chǎn)毒培養(yǎng)液50μL，稀釋的ST單克隆抗體50μL(先在ST單克隆抗體管中加O.5 mL稀釋液，混勻后全部吸出于1.6mL稀釋液中，混勻備用)，37℃水浴lh。(6)洗板：用洗滌液Ⅱ洗3次，操作同上。(7)加酶標(biāo)記免抗鼠Ig復(fù)合物：先在酶標(biāo)記免抗鼠Ig復(fù)合物管中加O.5mL稀釋液，混勻后全部吸出于3.6mL稀釋液中混勻，每孔加lOOμL，37℃水浴1h。(8)洗板：用洗滌液Ⅱ洗3次，操作同上。(9)酶底物反應(yīng)：每孔(包括第一孔)各加基質(zhì)液100μL，室溫下避光5～10 min，再加入終止液50μL。(10)結(jié)果判定：以酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)492nm下測(cè)定吸光度OD值：

目測(cè)無(wú)色或明顯淡于陰性對(duì)照為陽(yáng)性。

雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)檢測(cè)LT：將被檢菌株按五點(diǎn)環(huán)形接種于Elek氏培養(yǎng)基上。以同樣操作共做兩份，于36℃培養(yǎng)48h。在每株菌的菌苔上放多粘菌素B紙片，于36℃經(jīng)5～6h，使腸毒素滲入瓊脂中，在五點(diǎn)環(huán)形菌苔各5mm處的中央，挖一個(gè)直徑4mm的圓孔，并用一滴瓊脂墊底。在平板的中央孔內(nèi)滴加LT抗毒素30μL，用已知產(chǎn)LT和不產(chǎn)毒菌株作對(duì)照，于36^°C經(jīng)15～20h觀察結(jié)果。在菌斑和抗毒素孔之間出現(xiàn)白色沉淀帶者為陽(yáng)性，無(wú)沉淀帶者為陰性。

參考資料：食品衛(wèi)生微生物檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)手冊(cè)

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