2 結(jié)果與分析

2.1 冷激蛋白基因的克隆

通過(guò)16S測(cè)序結(jié)果的比對(duì)分析確定該菌為腐敗希瓦氏菌。以這株水產(chǎn)品腐敗希瓦氏菌的基因組DNA為模板，用相應(yīng)引物對(duì)冷激蛋白基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，結(jié)果如圖1所示。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度在500bp左右，與預(yù)期的產(chǎn)物大小相符。將PCR產(chǎn)物送至上海生工測(cè)序，并將測(cè)序序列用ORFFinder軟件和Blast分析。使用ORFFinder軟件的結(jié)果表明，克隆的基因片段都有完整的開放閱讀框（ORF），3個(gè)冷激蛋白基因Csp1589，Csp1376和Csp2252的ORF長(zhǎng)度分別為210，210，207bp，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TAA，分別編碼69，69，68個(gè)氨基酸。Blast結(jié)果表明，水產(chǎn)品腐敗希瓦氏菌的3個(gè)冷激蛋白基因與腐敗希瓦氏菌模式菌株的3個(gè)冷激蛋白基因的序列相似性均達(dá)100%，說(shuō)明冷激蛋白高度保守。

2.2 系統(tǒng)發(fā)生樹的構(gòu)建

使用MEGA7.0軟件構(gòu)建腐敗希瓦氏菌和大腸桿菌的冷激蛋白的系統(tǒng)發(fā)生樹，結(jié)果如圖2所示。水產(chǎn)品腐敗希瓦氏菌的冷激蛋白基因Csp1589和Csp1376與大腸桿菌的冷激蛋白基因CspA聚類在同一類群，表明它們之間的有較高的相似性和較近的親緣關(guān)系。大腸桿菌CspA為主要的冷誘導(dǎo)蛋白，低溫下大量表達(dá)。初步推測(cè)Csp1589和Csp1376在腐敗希瓦氏菌對(duì)低溫脅迫的適應(yīng)中起關(guān)鍵作用。腐敗希瓦氏菌的冷激蛋白基因Csp2252與大腸桿菌的冷激蛋白基因CspD位于同一分枝，大腸桿菌CspD在營(yíng)養(yǎng)缺乏時(shí)大量表達(dá)并能結(jié)合單鏈DNA，從而抑制染色體的復(fù)制，因此腐敗希瓦氏菌的冷激蛋白基因Csp2252可能與細(xì)胞生長(zhǎng)分化有關(guān)。

2.3 冷激蛋白的理化特點(diǎn)

利用ProtParam預(yù)測(cè)腐敗希瓦氏菌冷激蛋白的基本生理、生化特征，結(jié)果見表2。預(yù)測(cè)的腐敗希瓦氏菌冷激蛋白是由68～69個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，分子質(zhì)量在7.4ku左右的小分子蛋白，且其帶負(fù)電荷的氨基酸的量大于帶正電荷氨基酸的量，即酸性氨基酸的量大于堿性氨基酸的量，PＩ小于7，說(shuō)明這些蛋白質(zhì)都是酸性蛋白質(zhì)，符合CSPs的特點(diǎn)。蛋白質(zhì)的總平均親水性為負(fù)數(shù)，說(shuō)明測(cè)定的蛋白皆為親水性蛋白。由不穩(wěn)定系數(shù)可知，除Csp2252外，蛋白質(zhì)在體外的穩(wěn)定性都較好，在大腸桿菌體內(nèi)的半衰期大于10h。PSORT預(yù)測(cè)腐敗希瓦氏菌冷激蛋白皆定位于細(xì)胞質(zhì)。TMHMM預(yù)測(cè)結(jié)果顯示腐敗希瓦氏菌冷激蛋白均不存在α螺旋跨膜，是非跨膜蛋白。SignalＩP預(yù)測(cè)結(jié)果表明腐敗希瓦氏菌冷激蛋白不存在信號(hào)肽，不能分泌到胞外。推測(cè)腐敗希瓦氏菌的3個(gè)冷激蛋白均為非分泌型、非跨膜蛋白，冷激蛋白在腐敗希瓦氏菌細(xì)胞質(zhì)中合成后不進(jìn)行蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)，而是保留在細(xì)胞基質(zhì)中發(fā)揮作用。

2.4 冷激蛋白的氨基酸保守序列及結(jié)構(gòu)域分析

將腐敗希瓦氏菌冷激蛋白的氨基酸序列提交至CDservice，檢測(cè)結(jié)果顯示：腐敗希瓦氏菌的冷激蛋白Csp1589、Csp1376和Csp2252都具有DNA結(jié)合位點(diǎn)和RNA結(jié)合基序，且同屬于類S1總科。類S1總科是一類包含與核糖體蛋白S1的RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域相似的結(jié)構(gòu)域的蛋白合集。這種結(jié)構(gòu)最初在S1核糖體蛋白中被發(fā)現(xiàn)，目前已在多種RNA相關(guān)蛋白中被發(fā)現(xiàn)

SMART預(yù)測(cè)結(jié)果表明：腐敗希瓦氏菌的3個(gè)冷激蛋白都包含冷休克結(jié)構(gòu)域（Coldshockdomain，CSD），冷休克結(jié)構(gòu)域?qū)儆陬怱1總科這個(gè)超級(jí)家族，且其從原核生物到高等真核生物高度保守，具有RNA分子伴侶功能。包含冷休克結(jié)構(gòu)域的蛋白可以參與多種細(xì)胞生理生化過(guò)程，包括對(duì)低溫的適應(yīng)、營(yíng)養(yǎng)脅迫、細(xì)胞生長(zhǎng)和發(fā)育過(guò)程等。此外，由圖3可知腐敗希瓦氏菌的冷激蛋白Csp1589和Csp1376屬于保守蛋白結(jié)構(gòu)域家族CspC，是冷誘導(dǎo)蛋白，因此推測(cè)Csp1589和Csp1376與細(xì)菌對(duì)低溫的適應(yīng)性有關(guān)；而腐敗希瓦氏菌Csp2252不屬于CspC家族，其可能參與其它的細(xì)胞過(guò)程，這個(gè)結(jié)果與上述系統(tǒng)發(fā)生樹的結(jié)果一致。

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