一、目的和要求

①通過本實驗加深對凱氏定氮法測定原理的認識和理解。

②通過本實驗掌握凱氏定氮法中樣品消化、蒸餾、吸收等技能的操作。

二、原理

本實驗是利用蛋白質是含氮的有機化合物，當食品與硫酸和催化劑一同加熱消化時，使蛋白質分解，分解的氮與硫酸結合生成硫酸銨。然后再堿化蒸餾使氨游離，用硼酸吸收后再以鹽酸標準溶液滴定，最后根據酸的消耗量乘以換算系數，即為蛋白質含量。

三、儀器

①500mL凱氏燒瓶

②定氮蒸餾裝置

四、試劑

①硫酸銅

②硫酸鉀

③硫酸

④40g／L硼酸溶液

⑤混合指示劑

⑥400g／L氫氧化鈉溶液

⑦0.1000mol／L鹽酸標準溶液

五、實驗步驟

1、樣品的消化

將黃豆粉碎，過40目篩，混勻后準確稱取黃豆粉0.30g，小心移入100mL干燥的凱氏燒瓶中（勿黏附在瓶壁上），加入0.2g硫酸銅、3g硫酸鉀及5mL硫酸（每克樣品加硫酸15mL），稍搖勻后，將瓶以45^°斜支有石棉網的電爐上，先以小火緩慢加熱（沸騰的泡沫不超過瓶肚的2／3），待內容物全部炭化，泡沫完全停止后，加強火力，并保持瓶內液體微沸，直至液體呈藍色澄清透明后，再繼續(xù)加熱0.5h，完成消化。

待消化液冷至室溫后，用蒸餾水干凈地轉入100mL容量瓶中，并用蒸餾水定容，搖勻，（消化液在臨用前再稀釋定容）。

2、蒸餾與吸收

連接好微量定氮蒸餾裝置，于水蒸氣發(fā)生瓶內裝水至2／3容積處，加甲基橙指示劑數滴及硫酸數毫升，以保持水呈酸性，加入數粒玻璃珠，加熱煮沸水蒸氣發(fā)生瓶內的水。檢查裝置的氣密性。

在接收瓶內加入25mL 40g／L硼酸及2滴混合指示劑，將冷凝管下端插入液面以下。準確量取消化稀釋液10mL經漏斗口加入反應管內，用少量蒸餾水沖洗漏斗。經漏斗再加入10mL 40g／L氫氧化鈉溶液使其呈強堿性，立即夾好漏斗夾，并加少量水于進樣漏斗中封口，以防漏氣。夾緊廢液排出口的螺旋夾，進行水蒸氣蒸餾。蒸餾至冷凝管下端的吸收液變?yōu)榫G色開始計時，繼續(xù)蒸餾3min后，將冷凝管尖端提離液面再蒸餾1min，用蒸餾水沖洗冷凝管尖端后停止蒸餾。

3、滴定

吸收液用0.1000mol／L鹽酸標準溶液滴定至溶液出現(xiàn)微紅色在30s內不消失即為達到滴定終點。

4、空白試驗

不加試樣，按上述操作進行空白試驗。

六、結果處理

式中：ω——蛋白質的質量分數，％

c——HCl標準溶液的濃度，mol／L

V₁——滴定樣品吸收液時消耗鹽酸標準溶液體積，mL

V₂——滴定空白吸收液時消耗鹽酸標準溶液體積，mL

m——黃豆粉的質量，g

M——氮的摩爾質量，14.01g／mol

F——黃豆的蛋白質含量換算系數（5.71）

七、說明及注意事項

①消化過程應注意轉動凱氏燒瓶，利用冷凝酸液將附著在瓶壁上的炭粒沖下，以促進消化完全。

②樣品含脂肪或糖較多時，易產生泡沫，可加入少量辛醇或液體石蠟，或硅油消泡劑，防止其溢出瓶外，并注意適當控制熱源強度。

③硫酸銅起到催化作用，加速氧化分解。同時也是蒸餾時樣品液堿化的指示劑，若所加堿量不足，分解液呈現(xiàn)藍色不生成氫氧化銅沉淀，需再增加氫氧化鈉用量。

④蒸餾過程應注意接口處有無松漏現(xiàn)象，蒸餾完畢，先將蒸餾出口離開液面，繼續(xù)蒸餾1min，將附著在尖端的吸收液完全洗入吸收瓶內，再將吸收瓶移開，最后關閉電源，絕不能先關閉電源，否則吸收液將發(fā)生倒吸現(xiàn)象。

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