分子生物學(xué)是從分子水平研究生命本質(zhì)的一門新興邊緣學(xué)科。它以核酸和蛋白質(zhì)等生物大分子的結(jié)構(gòu)、組成和功能，以及它們?cè)谶z傳信息和細(xì)胞信息傳遞中的作用等為研究對(duì)象，是當(dāng)前生命科學(xué)中發(fā)展最快并正在與其他學(xué)科廣泛交叉和滲透的前沿領(lǐng)域。

目前分子生物學(xué)技術(shù)廣泛地應(yīng)用于生物科學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域，近些年來(lái)，核酸分子生物學(xué)技術(shù)，特別是核酸分子雜交和PCR技術(shù)在食品安全檢測(cè)方面也得到了很好的應(yīng)用。

二、PCR技術(shù)

聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)又稱無(wú)細(xì)胞分子克隆系統(tǒng)或特異性DNA序列體外引物定向酶促擴(kuò)增法。PCR技術(shù)具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、快速、對(duì)標(biāo)本的純度要求低、無(wú)放射性污染等特點(diǎn)，因而此方法在疾病診斷、法醫(yī)判定、考古研究、食源性病原菌和食品轉(zhuǎn)基因成分的檢測(cè)等方面也得到了廣泛的應(yīng)用并顯示出巨大的發(fā)展前景。

(一)PCR的原理

和天然DNA的復(fù)制過(guò)程一樣，PCR的DNA體外酶促擴(kuò)增包括變性、退火和延伸三個(gè)基本的過(guò)程，它們之間通過(guò)溫度的改變來(lái)實(shí)現(xiàn)相互轉(zhuǎn)換。所謂變性是指模板DNA在95℃左右的高溫下，雙鏈DNA解鏈成單鏈DNA，并游離于溶液中的過(guò)程；退火是指人工合成的一對(duì)引物在適合的溫度下(通常是50～65⁰C)分別與模板DNA需要擴(kuò)增區(qū)域的兩翼進(jìn)行準(zhǔn)確配對(duì)結(jié)合的過(guò)程；引物與模板DNA結(jié)合后，在適當(dāng)?shù)臈l件下(溫度一般為70～75⁰C)，以四種dNTP為材料，通過(guò)DNA聚合酶的作用，單核苷酸從引物的3’末端摻入，沿模板合成新股DNA鏈，這就是所謂的延伸。經(jīng)反復(fù)循環(huán)，使靶DNA片段呈指數(shù)增加。PCR的基本過(guò)程如圖3-22所示。

(二)PCR的操作過(guò)程

不同PCR的原理和操作過(guò)程基本相同，但是不同的PCR,其具體的操作過(guò)程和反應(yīng)溶液的組成稍有差異，在此僅就標(biāo)準(zhǔn)PCR的反應(yīng)過(guò)程和操作要點(diǎn)進(jìn)行敘述。

1、反應(yīng)體系

標(biāo)準(zhǔn)PCR的反應(yīng)體積為20～100μL，其中含有1×PCR緩沖溶液[50mmol/L KCl、10mmol/L Tris—HCI(pH 8.3)、2mmol/LMgCl₂、lOOμg／mL明膠]、四種dNTP各20μmol/L、一對(duì)引物各O.25μmol/L、DNA模板0.1μg左右(根據(jù)具體情況加以調(diào)整，一般需要10²～10⁵拷貝的DNA)和2U的Taq DNA聚合酶。

2、反應(yīng)步驟

在O.5mL的小離心管中依次加入PCR的反應(yīng)緩沖液、四種dNTP、引物、DNA模板，混勻，95℃加熱10min，以除去樣品中蛋白酶、氯仿等對(duì)Taq DNA聚合酶的影響，然后，每管加入2U的Taq DNA聚合酶，混勻，離心30s，加50μL液體石蠟封蓋反應(yīng)體系，以防止反應(yīng)液揮發(fā)(現(xiàn)在有些PRC由于具有很好的密封性，也可以不加液體石蠟)，同時(shí)根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求設(shè)計(jì)PCR儀的各種循環(huán)參數(shù)，將離心管置于PCR儀中進(jìn)行PCR循環(huán)。

3、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)

PCR擴(kuò)增結(jié)束后，根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡牟煌?，可以采用多種方法對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分析，下面介紹其中較為常用的幾種方法。

(1)凝膠電泳分析：PCR產(chǎn)物電泳，EB(溴化乙錠)染色，紫外燈下觀察，初步判斷產(chǎn)物的特異性，包括瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳。

①瓊脂糖凝膠電泳：根據(jù)擴(kuò)增片段的大小，采用適當(dāng)濃度的瓊脂糖制成凝膠，取PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物5～10μL點(diǎn)樣于凝膠中，電泳，EB染色，紫外燈下觀察，成功的PCR擴(kuò)增可得到分子量均一的一條區(qū)帶，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)分子量譜帶對(duì)PCR產(chǎn)物譜帶進(jìn)行分析。

②聚丙烯酰胺凝膠電泳：6％～10％聚丙烯酰胺凝膠電泳分離效果比瓊脂糖好，條帶比較集中，可用于科研及檢測(cè)分析。

(2)分子雜交：包括斑點(diǎn)雜交、Southern印跡雜交和微孔板夾心雜交等。在這些雜交中，通過(guò)分析PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物與相應(yīng)探針結(jié)合后的雜交體，從而判斷出PCR產(chǎn)物是否是預(yù)先設(shè)計(jì)的目的片段，還能鑒定出產(chǎn)物中是否存在突變，以及擴(kuò)增產(chǎn)物的大小和特異性等。有關(guān)這些雜交的具體操作過(guò)程，請(qǐng)參閱相關(guān)文獻(xiàn)。

(3)核酸序列分析：分析PCR產(chǎn)物的序列，是檢測(cè)PCR產(chǎn)物特異性最可靠的方法。

(4)顏色互補(bǔ)分析法：顏色互補(bǔ)分析法是利用三原色原理，當(dāng)不同DNA片段(例如在多重PCR中A和B兩個(gè)片段)同時(shí)擴(kuò)增時(shí)，用引物5’端修飾技術(shù)將不同引物用不同顏色熒光素標(biāo)記(A片段引物標(biāo)記綠色的熒光素，B標(biāo)記紅色的羅丹明)。如果僅有一條片段被擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物激發(fā)后，只有一種顏色(紅色或綠色)；如果兩條不同大小的片段均被擴(kuò)增，可通過(guò)電泳分離，紫外激發(fā)后可觀察到不同顏色的兩條帶；如果兩條被擴(kuò)增片段大小相同，電泳后可見一條紅綠互補(bǔ)色的黃色帶；如果不用電泳法分離擴(kuò)增片段，通過(guò)一定手段除去未摻入引物，亦可觀察到擴(kuò)增產(chǎn)物的顏色，此時(shí)，擴(kuò)增產(chǎn)物無(wú)論大小，只要均被擴(kuò)增，就可見一條紅綠互補(bǔ)色的黃色帶。

該法簡(jiǎn)便、易于自動(dòng)化，可用于檢測(cè)基因缺失、染色體轉(zhuǎn)位和病原微生物，例如采用多重PCR，結(jié)合顏色互補(bǔ)分析法，通過(guò)觀察PCR產(chǎn)物的顏色，可以同時(shí)快速檢測(cè)多種病原菌，是當(dāng)今食品安全快速檢測(cè)的發(fā)展方向之一。

(三)PCR的類型

PCR技術(shù)自誕生以來(lái)，發(fā)展迅速，應(yīng)用面廣。因?qū)嶒?yàn)材料、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蛯?shí)驗(yàn)要求等的不同，在標(biāo)準(zhǔn)PCR的基礎(chǔ)上，已衍生出近幾十種不同類型的PCR，主要有不對(duì)稱PCR、多重PCR、反向PCR、標(biāo)記PCR、定量PCR等，這些PCR和標(biāo)準(zhǔn)PCR的原理相同，但是由于實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡牟煌髯缘木唧w操作過(guò)程稍有不同，此處不再逐一介紹。

三、生物芯片技術(shù)

生物芯片也稱為微陣列，它利用微電子、微機(jī)械、化學(xué)和物理技術(shù)、計(jì)算機(jī)技術(shù)，使樣品檢測(cè)、分析過(guò)程實(shí)現(xiàn)連續(xù)化、集成化、微型化。因此，生物芯片具有多元化、高通量、檢測(cè)時(shí)間短、樣品用量少和便于攜帶等諸多優(yōu)點(diǎn)。

生物芯片技術(shù)主要包括四個(gè)基本要點(diǎn)：芯片陣列的構(gòu)建、樣品的制備及標(biāo)記、生物分子反應(yīng)、信號(hào)檢測(cè)和數(shù)據(jù)處理。

①芯片陣列的構(gòu)建：將DNA片段或蛋白質(zhì)等生物分子按設(shè)計(jì)好的順序排列在表面處理過(guò)的載體上。

②樣品的制備及標(biāo)記：生物樣品往往是非常復(fù)雜的生物分子混合體，除少數(shù)特殊樣品外，一般不能直接與芯片反應(yīng)，因此要對(duì)樣品進(jìn)行生物處理，以獲取其中所需的蛋白質(zhì)或核酸等分子，并對(duì)其進(jìn)行標(biāo)記，作為后續(xù)反應(yīng)的檢測(cè)信號(hào)。

③生物分子反應(yīng)：芯片上的生物分子之間的反應(yīng)是芯片檢測(cè)的關(guān)鍵一步。通過(guò)選擇合適的反應(yīng)條件使生物分子間的反應(yīng)處于最佳狀況中，減少生物分子之間的錯(cuò)配比例。

④信號(hào)檢測(cè)和數(shù)據(jù)處理：常用的檢測(cè)方法是將芯片置入芯片掃描儀中，通過(guò)掃描以獲得有關(guān)生物信息，然后利用計(jì)算機(jī)軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。

生物芯片類型可以從不同的角度來(lái)劃分。當(dāng)前人們常常提到的基因芯片、蛋白質(zhì)芯片和芯片實(shí)驗(yàn)室，就是從芯片的檢測(cè)對(duì)象和使用目的來(lái)區(qū)分的。此外，還有組織芯片、細(xì)胞芯片等具有不同檢測(cè)目的的芯片。

參考資料：食品檢測(cè)技術(shù)