2.5加標(biāo)回收試驗

取1mg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液50、200uL、1.0mL于10mL容量瓶中，用甲醇分別稀釋成5.0、20.0、100.0ug/mL三個濃度梯度的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液。每種基質(zhì)做低、中、高三個濃度加標(biāo)：每個梯度取200uL混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液分別加入膠囊、片劑和顆粒劑空白基質(zhì)樣品中將片劑、顆粒劑和膠囊(內(nèi)容物)樣品細(xì)致研磨，得到均質(zhì)樣品后稱量，稱取0.1000g左右樣品于100mL容量瓶中，加入甲醇適量，超聲提取30min，冷卻至室溫，用甲醇定容至刻度，搖勻，靜置，取上清液經(jīng)0.22μm有機(jī)濾膜過濾，取濾液待測。若陽性樣品濃度超出線性范圍則用甲醇按一定比例稀釋后再測。每個梯度檢測三組平行樣品。色譜柱：PhenomenexKjneLex-C₁₈色譜柱，規(guī)格50mm×2.1mm，2.6μm；柱溫：40℃；流動相：A為乙腈，B為10mmol/L乙酸銨水溶液；梯度洗脫：0～7min，10％A～90％A，7～8min，90％A，8～8.1min，90％A～10％A，8.1～10min，10％A；流速：250μL/min；進(jìn)樣量：1μL。離子源：TurboV電噴霧離子源(ESI)；掃描模式：正、負(fù)離子同時掃描，定時多反應(yīng)監(jiān)測→信息依賴性獲取→增強(qiáng)型子離子掃描(ScheduledMRM→TDA→EP)；掃描范圍：50～650Da；氣簾氣(CUR)：30psi；碰撞氣(CAD)：High；噴霧電壓(IS)：5500V/-4500V；離子源溫度：550℃；霧化氣(GASl)：55psi；輔助氣(GAS2)：55psi進(jìn)行加標(biāo)回收率測定。30種目標(biāo)化合物加標(biāo)回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，結(jié)果表明，30種化合物的回收率在84.5％～104.7％之間，RSD均小于5.0％，加標(biāo)回收試驗精密度良好。

2.6精密度和標(biāo)準(zhǔn)品溶液穩(wěn)定性試驗

精確吸取50μL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液將30種違禁添加藥物分別稱取約10mg，置于10mL容量瓶中，11種那非類標(biāo)準(zhǔn)品中加入一定量的乙腈超聲溶解后定容，其余標(biāo)準(zhǔn)品加入一定量甲醇超聲溶解后定容，均配制成濃度約為1mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品儲備液，并保存于-4℃冰箱中。
混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制：分別精確吸取30種標(biāo)準(zhǔn)品儲備液適黃于一個100mL容量瓶中，用甲醇稀釋混勻后定容。使?jié)舛葹?～10μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，待使用時進(jìn)一步稀釋。于10mL容最瓶，用甲醇稀釋，配制成濃度為5～100ng/mL的混合標(biāo)液，色譜柱：PhenomenexKjneLex-C₁₈色譜柱，規(guī)格50mm×2.1mm，2.6μm；柱溫：40℃；流動相：A為乙腈，B為10mmol/L乙酸銨水溶液；梯度洗脫：0～7min，10％A～90％A，7～8min，90％A，8～8.1min，90％A～10％A，8.1～10min，10％A；流速：250μL/min；進(jìn)樣量：1μL。

離子源：TurboV電噴霧離子源(ESI)；掃描模式：正、負(fù)離子同時掃描，定時多反應(yīng)監(jiān)測→信息依賴性獲取→增強(qiáng)型子離子掃描(ScheduledMRM→TDA→EP)；掃描范圍：50～650Da；氣簾氣(CUR)：30psi；碰撞氣(CAD)：High；噴霧電壓(IS)：5500V/-4500V；離子源溫度：550℃；霧化氣(GASl)：55psi；輔助氣(GAS2)：55psi連續(xù)進(jìn)樣6次，測定30種化合物定量離子對質(zhì)潛峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。將濃度為5～100ng/mL的混合標(biāo)液在避光冷藏0、1、2、4、8、12、24h后分別色譜柱：PhenomenexKjneLex-C18色譜柱，規(guī)格50mm×2.1mm，2.6μm；柱溫：40℃；流動相：A為乙腈，B為10mmol/L乙酸銨水溶液；梯度洗脫：0～7min，10％A～90％A，7～8min，90％A，8～8.1min，90％A～10％A，8.1～10min，10％A；流速：250μL/min；進(jìn)樣量：1μL。

離子源：TurboV電噴霧離子源(ESI)；掃描模式：正、負(fù)離子同時掃描，定時多反應(yīng)監(jiān)測→信息依賴性獲取→增強(qiáng)型子離子掃描(ScheduledMRM→TDA→EP)；掃描范圍：50～650Da；氣簾氣(CUR)：30psi；碰撞氣(CAD)：High；噴霧電壓(IS)：5500V/-4500V；離子源溫度：550℃；霧化氣(GASl)：55psi；輔助氣(GAS2)：55psi方法檢測，以提取的30種日標(biāo)物定量離子對質(zhì)譜岡峰而積計算其RSD。結(jié)果表明，本方法中30種違禁添加藥物的精密度(RSD)為0.8％～5.6％，均小于6％，精密度良好，且混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7樣品檢測

采用本方法對50批次緩解疲勞類和改善睡眠類保健品進(jìn)行檢測，外標(biāo)法定量。實驗結(jié)果顯示，檢出陽性樣品共8批次，定量結(jié)果見表5。每批次陽性樣品至少同時檢出兩種違禁添加藥物，其中檢出最多的化合物是硝西泮和炯酸，各檢出5批次，其次是西地那非，共檢出3批次，氯硝西泮、文法拉辛、硫代艾地那非各檢出2批次，氯苯那敏檢出1批次。所有陽性樣品EPI譜圖均經(jīng)過EPI數(shù)據(jù)庫(2.3)比對確證，以Fit、RevFit和Purity三個參數(shù)表示檢索結(jié)果，其數(shù)值體現(xiàn)與目標(biāo)化合物的匹配程度。其中FiL(F)代表正符合率，即標(biāo)準(zhǔn)品譜峰與樣品譜峰的相似度，最大值為100，值越大說明是該化合物的可能性越大；RevFit(R)代表反符合率，即樣品譜圖與標(biāo)準(zhǔn)品譜圖的相似度；Purity(P)代表純度，是綜合前兩種結(jié)果得出的數(shù)值，即樣品譜圖與數(shù)據(jù)庫中的標(biāo)準(zhǔn)品譜圖之問在質(zhì)量數(shù)、豐度等參數(shù)方面的相似度。EPI數(shù)據(jù)庫搜庫結(jié)果中目標(biāo)化合物按照P值從大到小的順序排列；部分陽性樣品質(zhì)譜對比圖見圖3。

3結(jié)論

本實驗采用高效液相色譜-三重四極桿復(fù)合離子阱質(zhì)譜(HPLC-QTRAP-MS)對緩解疲勞類和改善睡眠類保健品中30種違禁添加藥物建立了快速檢測方法。在8min以內(nèi)完成了對30種化合物的檢測。該方法選用乙腈-10mmoL/L乙酸銨溶液作為流動相，PhenomenexKinetexC18(50mm×2.1mm，2.6μm)柱為色譜柱進(jìn)行分離；選用定時多反應(yīng)監(jiān)測(SchedulenedMRM)模式下的正、負(fù)離切換方式進(jìn)行定量檢測分析；選用定時多反應(yīng)臨測(ScheduledMRM)-信息依賴性采集(IDA)-增強(qiáng)子離子掃捕(EPI)掃描模式，在定量分析的同時獲得3個能力級別的二級碎片離子質(zhì)譜圖復(fù)合而成的增強(qiáng)型二級碎片離子(EPI)質(zhì)譜圖，建立30種化合物的EPI數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行定性確證。

本方法采用正負(fù)離子同時掃描模式，可以同時檢測30種違禁添加藥物，加快了檢測速度；選擇ScheduledMRM采集方式，獲得最佳色譜峰進(jìn)行定量分析，提高了檢測靈敏度和定量準(zhǔn)確性；建立了EPI數(shù)據(jù)庫用于陽性確證和結(jié)構(gòu)分析，確保了定性準(zhǔn)確性；優(yōu)化了搜庫比對步驟，設(shè)置系統(tǒng)自動切換離子阱模式，在線采集EPI圖譜，計算比對結(jié)果，縮短分析時問，加快定性速度。本方法實現(xiàn)了一針進(jìn)樣同時對30種違禁添加藥物進(jìn)行定量、定性和確證，具有通量大、速度快、操作簡便、靈敏度高、準(zhǔn)確性強(qiáng)能的特點(diǎn)，為新形勢下的保健食品監(jiān)管提供有效的技術(shù)支持。

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