一、核酸探針標(biāo)記物種類及其特點(diǎn)

探針標(biāo)記的目的是為了跟蹤探針的去向，確定探針是否與相應(yīng)的基因組DNA雜交，即顯示出與核酸探針具有同源性序列的精確位置，從而判斷陽(yáng)性菌落的位置、靶核酸在細(xì)胞中的位置(原位雜交)，或特異性片段的大小(轉(zhuǎn)移印跡雜交)等。

一種理想的探針標(biāo)記物，應(yīng)具備以下幾種特性：①高度靈敏性；②標(biāo)記物與核酸探針?lè)肿拥慕Y(jié)合，應(yīng)絕對(duì)不能影響其堿基配對(duì)特異性；③應(yīng)不影響探針?lè)肿拥闹饕砘匦裕貏e是雜交特異性和雜交穩(wěn)定性，雜交體的解鏈溫度(t_m)應(yīng)無(wú)較大的改變；④當(dāng)用酶促方法進(jìn)行標(biāo)記時(shí)，應(yīng)對(duì)酶促活力(K_m)無(wú)較大的影響，以保證標(biāo)記反應(yīng)的效率和標(biāo)記產(chǎn)物的比活性，當(dāng)標(biāo)記探針還繼續(xù)作為下一步酶促反應(yīng)的底物(如用于DNA序列測(cè)定)時(shí)，應(yīng)不能影響此步驟的酶活性；⑤檢測(cè)方法除要求高度靈敏性外，還應(yīng)具有高度特異性，盡量減低假陽(yáng)性率。如果要求更嚴(yán)一些，它還應(yīng)具有較高的化學(xué)穩(wěn)定性，保存時(shí)間較長(zhǎng)，標(biāo)記及檢測(cè)方法簡(jiǎn)單，對(duì)環(huán)境無(wú)污染，對(duì)人體無(wú)損傷，價(jià)格低廉等。常用的探針標(biāo)記物有兩類：放射性核素和非放射性核素標(biāo)記物。

(一)放射性核素

放射性核素是目前應(yīng)用較多的一類探針標(biāo)記物，包括³²P、³H和³⁵S等，主要優(yōu)點(diǎn)：①放射性核素的靈敏度極高，可以檢測(cè)到10¹⁸一10^-14g的物質(zhì)，在最適條件下，可以測(cè)出樣品中少于1000個(gè)分子的核酸含量；②放射性核素與相應(yīng)的元素具有完全相同的化學(xué)性質(zhì)，因此對(duì)各種酶促反應(yīng)無(wú)任何影響，也不會(huì)影響堿基配對(duì)的特異性、穩(wěn)定性和雜交性質(zhì)；③放射性核素的檢測(cè)具有極高的特異性，少數(shù)假陽(yáng)性結(jié)果的出現(xiàn)，極少是由于放射性核素引起的，而主要是由雜交過(guò)程本身導(dǎo)致的。按嚴(yán)格規(guī)程操作(主要是預(yù)雜交和洗膜)則假陽(yáng)性率極低。

其主要缺點(diǎn)：①易造成放射性污染；②當(dāng)標(biāo)記活性極高時(shí)，放射線可以造成核酸分子結(jié)構(gòu)的破壞；③多數(shù)放射性核素的半衰期都較短，因此必須隨用隨標(biāo)，標(biāo)記后立即使用，不能長(zhǎng)期存放(³H與¹⁴C除外)。常用作探針標(biāo)記物放射性核素有：

(1)³²P。³²P放射性強(qiáng)，其所釋放的β一粒子能量高，穿透力較強(qiáng)，因此放射自顯影所需時(shí)間短，靈敏度高，被廣泛應(yīng)用于各種濾膜雜交以及液相雜交中，特別適合于基因組中單拷貝基因的檢測(cè)。其缺點(diǎn)是半衰期短；射線散射嚴(yán)重，導(dǎo)致X線片上帶型輪廓不清，有時(shí)會(huì)影響到結(jié)果的分析，特別是當(dāng)要求高分辨率時(shí)(如DNA序列測(cè)定和細(xì)胞原位雜交)。³²P大多是以標(biāo)記的各種核苷酸(³²P—NTP)和脫氧核糖核苷酸(³²P—dNTP)的形式提供的。

(2)³⁵S,³⁵S原子可以取代磷酸分子上的一個(gè)氧原子，從而形成筘s標(biāo)記的核苷酸分子。核苷酸分子結(jié)構(gòu)上的這種改變，對(duì)于大多數(shù)核酸修飾酶(如DNA和RNA聚合酶、激酶和磷酸酶等)的活性沒(méi)有太大的影響，是其適宜的反應(yīng)底物，可以直接替代。³²P標(biāo)記的核苷酸用于探針標(biāo)記。也有報(bào)道表明，這種結(jié)構(gòu)上的改變會(huì)抑制DNA聚合酶的活性，使其摻入速率下降。

(3)³H,³H釋放的屆粒子能量極低，散射極少，因此在感光乳劑上的成影分辨率最高，本底較低，最適用于細(xì)胞原位雜交，但放射自顯影所需時(shí)間較長(zhǎng)。目前也有較多的人用³²P和³⁵S代替³H進(jìn)行原位雜交。³H的另一優(yōu)點(diǎn)是半衰期長(zhǎng)，標(biāo)記的探針可存放較長(zhǎng)時(shí)間。

(4)¹²⁵I和¹³¹I碘放射性同位素在20世紀(jì)70年代曾被廣泛用于核酸探針的標(biāo)記，現(xiàn)已極少被采用，但碘放射性同位素仍然有其特有的優(yōu)點(diǎn)：①可以用化學(xué)方法直接進(jìn)行標(biāo)記，操作簡(jiǎn)單，特別適合于RNA探針的標(biāo)記；②放射線的散射作用較弱，分辨率較高，與³H差不多，而曝光時(shí)間則短得多，比較適合于細(xì)胞原位雜交；③來(lái)源方便，價(jià)格低廉。比較而言，¹²⁵I較¹³¹I好，因?yàn)?sup>125I的半衰期較長(zhǎng)、射線的能量較低。碘同位素最大的缺點(diǎn)是具有揮發(fā)性，雖然碘同位素一般是以不具有揮發(fā)性的碘化鈉形式提供的，但在反應(yīng)過(guò)程中還是有可能產(chǎn)生揮發(fā)性碘，被人吸收后蓄積在甲狀腺中不易被排出，致使機(jī)體接受長(zhǎng)期照射。

(二)非放射性標(biāo)記物

非放射性指示系統(tǒng)是基于選用特異的互補(bǔ)探針相互作用來(lái)檢測(cè)各種生物靶分子。適宜的檢測(cè)系統(tǒng)是與這些探針配對(duì)的，直接通過(guò)共價(jià)結(jié)合，或間接地通過(guò)附加的特異高親和力的相互作用。新近發(fā)展起來(lái)的非放射性系統(tǒng)大多數(shù)是基于報(bào)告基因的酶學(xué)、生物化學(xué)或化學(xué)的結(jié)合。這些基團(tuán)能被具有高靈敏光學(xué)的、發(fā)光的、熒光的或金屬沉淀的檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)出來(lái)。

不同的非放射性系統(tǒng)可以分類為直接的和間接的兩種類型，它們之間的差別在于檢測(cè)反應(yīng)的成分種類及其反應(yīng)步驟的次數(shù)。直接系統(tǒng)大多是被用于檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)化的靶生物分子，而間接系統(tǒng)常常被用于檢測(cè)具有變異特性的不同靶生物分子。

用于直接系統(tǒng)的報(bào)告基團(tuán)是直接地與探針結(jié)合，常使用的直接報(bào)告基團(tuán)是熒光染料[如熒光素及堿性蕊香紅(Rhodamine)]和標(biāo)志酶如堿性磷酸酶(AP)，或辣根過(guò)氧化物酶(HRP)與化學(xué)發(fā)光檢測(cè)結(jié)合。

在間接系統(tǒng)中，報(bào)告基團(tuán)通過(guò)探針的修飾基團(tuán)和被結(jié)合到修飾探針的特異指示劑分子之間非共價(jià)鍵的相互作用，間接地結(jié)合在一起。因此，間接系統(tǒng)首先要求用于特異分析的探針需預(yù)先導(dǎo)入特殊修飾基團(tuán)。用作修飾基團(tuán)的已知系統(tǒng)有維生素(如生物素)或各種半抗原，如地高辛、熒光素、二硝基苯基(DNP)、溴脫氧尿核苷或免疫金(Immunogold)。

在問(wèn)接的非放射性系統(tǒng)中，最重要的系統(tǒng)是地高辛配基、生物素和熒光素系統(tǒng)。

1、地高辛配基系統(tǒng)

異羥基洋地黃毒苷配基，簡(jiǎn)稱地高辛配基(Digoxigenin，DIG)，是一種類固醇半抗原，自然界存在于洋地黃植物。dUTP是通過(guò)問(wèn)臂連接類固醇半抗原地高辛配基(DIG—Dutp)。雜交反應(yīng)后，雜交的靶DNA通過(guò)酶聯(lián)免疫法與一個(gè)抗體復(fù)合物[抗地高辛配基堿性磷酸酶復(fù)合物(AIG-AP)]結(jié)合，接著在5-溴-4-氯-3-吲哚酸鹽(X-磷酸鹽)和硝基藍(lán)四唑鹽(NBT)存在下，由酶催化生成顏色反應(yīng)。

2、生物素系統(tǒng)

在生物素(Biotin)系統(tǒng)中，結(jié)合的成分被加入的維生素生物素所修飾，而結(jié)合的生物素可用與它相黏合的指示劑蛋白，即抗生物素蛋白(Avidin)或鏈抗生物素蛋白(Streptavidin)進(jìn)行測(cè)定，抗生物素蛋白來(lái)自雞蛋蛋白，鏈抗生物素蛋白分離自鏈酶菌屬抗生物素蛋白。每種蛋白質(zhì)有四個(gè)與生物素高親和力的結(jié)合位點(diǎn)，結(jié)合常數(shù)為K=10¹⁵／mol。標(biāo)記的生物素已廣泛地被用于多種不同的檢測(cè)，包括核酸、蛋白質(zhì)和聚糖印跡在溶液或原位中的檢測(cè)，其檢測(cè)類型包括直接或間接兩種形式。

3、熒光素系統(tǒng)

熒光系(Ieuorescein)是另一種基礎(chǔ)抗體系統(tǒng)，在此系統(tǒng)中熒光素標(biāo)簽(Fquoresceintag)被用作修飾基團(tuán)，以其高親和力抗體與標(biāo)志酶(如堿性磷酸酶A)相結(jié)合。檢測(cè)核苷酸的靈敏度可達(dá)皮克(pg)以下。如同DIG系統(tǒng)一樣，特殊的熒光素抗體的特異性是高的。熒光素修飾對(duì)光是敏感的，因此應(yīng)用這種修飾基團(tuán)標(biāo)記的試劑應(yīng)注意避免光照。聯(lián)合使用DIG生物素和熒光素標(biāo)記的探針，可以達(dá)到同時(shí)對(duì)三種不同特異序列的多顏色檢測(cè)。

4、二硝基苯基系統(tǒng)

二硝基苯基(Dinitrophenyl，DNP)指示劑系統(tǒng)的建立，主要是為了用DNP作為修飾基團(tuán)的原位方法和特異的DNP鼠單克隆IgG抗體，最終的熒光信號(hào)或酶的信號(hào)，被用合適的抗鼠IgG結(jié)合而產(chǎn)生。

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