一、測(cè)定意義

在通氣良好的土壤中，以肥料形式施入土壤和有機(jī)氮礦化產(chǎn)生的銨態(tài)氮會(huì)在微生物的作用下很快轉(zhuǎn)化為硝態(tài)氮，這種過程即為硝化作用。測(cè)定土壤硝化微生物數(shù)量，對(duì)了解土壤中氮素轉(zhuǎn)化、供應(yīng)狀況、氮素的植物有效性和移動(dòng)性，具有一定意義。

二、方法選擇的依據(jù)

土壤中的硝化微生物有自養(yǎng)的，也有異養(yǎng)類型，在絕大多數(shù)土壤中，硝化過程是由自養(yǎng)硝化細(xì)菌完成的。在酸性土壤中，有時(shí)也有相當(dāng)數(shù)最的異養(yǎng)硝化微生物。

自養(yǎng)硝化細(xì)菌在氨氧化為亞硝酸進(jìn)而氧化為硝酸的過程中獲得的能量，用于CO₂的固定和生命代謝活動(dòng)。這類微生物又分為亞硝酸細(xì)菌(氮氧化細(xì)菌)和硝酸細(xì)菌(亞硝酸氧化細(xì)菌)。前者參與氨氧化為亞硝酸的過程，后者能夠?qū)喯跛徇M(jìn)一步氧化為硝酸。

異養(yǎng)硝化微生物能夠利用無機(jī)或有機(jī)氮化合物并將氨或有機(jī)胺化合物氧化成亞硝酸和硝酸。在異養(yǎng)硝化過程中，這些微生物一般不需要從這一過程獲取能最，至少不是將其作為唯一的能源。異養(yǎng)硝化微生物包括細(xì)菌、真菌和放線菌，主要在酸性土壤中參與硝化過程，而且反應(yīng)速率較慢，但現(xiàn)有的硝化抑制劑對(duì)這類微生物基本不起作用。

三、測(cè)定原理—最大可能(或然)計(jì)數(shù)(MPN)法

自養(yǎng)硝化微生物在土壤中分布非常廣泛，只是在酸性土壤中活性較低。因此，用正常土壤樣品測(cè)定的硝化徽生物基本上是自養(yǎng)硝化細(xì)菌，然而，與異養(yǎng)硝化微生物相比，自養(yǎng)硝化細(xì)菌在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)非常緩慢，難以在固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，導(dǎo)致分離、純化和直接測(cè)定比較困難。因此，常用最大可能計(jì)數(shù)法，即通過概率統(tǒng)計(jì)的方法間接地估計(jì)土壤中硝化微生物群體的豐度。

最大可能計(jì)數(shù)法又稱最大或然計(jì)數(shù)法或稀釋頻度計(jì)數(shù)法，適用于測(cè)定在一個(gè)混雜的微生物群中雖不占優(yōu)勢(shì)，但卻具有特殊生理功能的類群。該方法系經(jīng)過一系列稀釋，直到取少量稀釋液，接種到適宜的選擇性液體培養(yǎng)基，經(jīng)過一定時(shí)間的培養(yǎng)，對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行定性檢測(cè)。但該方法要求在稀釋系列中，最后一個(gè)稀釋度的所有重復(fù)間都沒有待測(cè)菌生長(zhǎng)。

菌液經(jīng)過多次10倍稀釋后，一定盈菌液中可以極少或無菌，選擇5個(gè)連續(xù)的稀釋度，每個(gè)稀釋度取3個(gè)～5個(gè)重復(fù)接種于適宜的液體培養(yǎng)基中。培養(yǎng)后，分別記載結(jié)果得出數(shù)量指標(biāo)，即取稀釋系列中所有重復(fù)管都有細(xì)菌生長(zhǎng)(或生化反應(yīng)為正者)的最后稀釋度為數(shù)量指標(biāo)的第一位數(shù)字，再取兩個(gè)連續(xù)的數(shù)即為數(shù)量指標(biāo)。由表查出近似值，再乘以數(shù)量指標(biāo)第一位數(shù)的稀釋倍數(shù)，即為原菌液中的含菌數(shù)。例如，硝化細(xì)菌有5個(gè)重復(fù)，稀釋度為10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7稀釋液中出現(xiàn)生長(zhǎng)的管數(shù)分別為5,5,5,4,1,0，則數(shù)量指標(biāo)為“5,4,1”。查表可得細(xì)菌個(gè)數(shù)的近似值為17.0。那么。1mL原菌液中的活細(xì)菌數(shù)=17.O×10,000=1.7×10⁵個(gè)。計(jì)算每克土壤中的活菌數(shù),可按下式計(jì)算:

四、氨氧化細(xì)菌的測(cè)定

1、方法原理

經(jīng)過一定時(shí)間培養(yǎng)，利用氨氧化細(xì)菌在硝化過程中質(zhì)子的釋放并導(dǎo)致介質(zhì)pH的改變，估計(jì)氨氧化過程的存在和完成的時(shí)間，然后通過檢測(cè)氨氧化的產(chǎn)物NO₂^-和NO₃^-(分別用Griess和二苯胺)，最終確定單個(gè)試管中是否有氨氧化微生物。最后，用最大可能計(jì)數(shù)法估計(jì)土壤中氨氧化微生物的數(shù)量。

2、儀器

高壓滅菌鍋；恒溫培養(yǎng)箱；勻漿機(jī)；高壓滅過菌的10mL試管和150mL三角瓶；比色盤。

3、試劑

（1）培養(yǎng)基備用液：用蒸餾水或去離子水按下列濃度分別配制各組分，貯存?zhèn)溆茫?/p>

（2）培養(yǎng)基:分別取10.0mL(NH₄)₂SO₄溶液、1.0mLCaCl₂·2H₂O溶液,1.0mLMg-SO₄·7H₂O溶液、5.0mL溴百里酚藍(lán)溶液(pH指示劑), 7.5mLKH₃PO₄溶液、1.0mL鰲合鐵溶液和1.0mL微量元家溶液混合，用碳酸鉀溶液〔p(K₂CO₃= 20g·L^-1〕調(diào)pH至p17.0～pH7.2，稀釋至1000mL。每試管中加入4mL該液體培養(yǎng)基，高溫滅菌(121⁰C下15min)。

（3）稀釋劑(磷酸鹽級(jí)沖溶液):用于稀釋土壤樣品的溶液是1mmol·L^-1的K₂HPO₄^-KH₂PO₄級(jí)沖溶液，其配制系取上述備用液中KH₂PO₄溶液4mL和K₂HPO₄溶液1mL，稀釋至1L。此級(jí)沖液的pH值為pH7.1～pH7.4，分別取若干份90 MI，此緩沖液分裝于若干個(gè)有蓋的瓶中(或150 ml三角瓶中，用鋁箔封嚴(yán)),然后，高溫滅菌(121⁰C下15min)。

（4）修正后的Griess-llosvay試劑:①重氮試劑:將0.5g對(duì)氨基苯磺胺溶于100 mL鹽酸溶液[c(HCI)=2.4 mol·L^-1〕中，低溫貯存。②藕合劑:將0.3g的N-(1-萘基)-乙二胺鹽酸鹽溶于100mL鹽酸溶液[c(HCI)]=0.12 mol·L^-1〕中，保存在棕色瓶中，低溫貯藏。

（5）二苯胺試劑:取50mg二苯胺溶于25mL濃硫酸中。在有玻璃塞子的棕色瓶中避光貯存，其有效使用時(shí)間最多兩周。

（6）碳酸鉀溶液〔p(K₂CO₃)=20g ·L^-1)]，經(jīng)過濾滅菌處理后用于調(diào)節(jié)試管中的pH值。

4、操作步驟

稱取10.00g新鮮土樣和上述90mL滅過菌的緩沖液一起加入到勻槳機(jī)中，攪拌30S或60S，然后轉(zhuǎn)移至高壓滅過菌的150mL三角瓶中，搖勻后吸取10mL該稀釋度為10^-1的土壤懸浮液至另一只預(yù)先滅過苗的裝有90mL磷酸鹽級(jí)沖液的三角瓶中，搖勻，得到稀釋度為10⁰¹的土壤懸浮液。繼續(xù)稀釋至10^-5。如果硝化細(xì)菌的數(shù)量較高，應(yīng)進(jìn)一步稀釋至10^-6,10^-7或10^-8。取5個(gè)連續(xù)的稀釋度，將其分別接種到裝有 4mL滅菌的液體培養(yǎng)基的試管中。每管接種土壤懸浮液1mL，每個(gè)稀釋度重復(fù)接種5管，即每個(gè)土樣共制備25個(gè)試管，同時(shí)設(shè)置不接種的對(duì)照。試管在25⁰C～30⁰C避光培養(yǎng)(培養(yǎng)箱中或合適的室溫條件下)。

21d后，取試管進(jìn)行初步觀察， pH指示劑顏色由藍(lán)綠色變?yōu)辄S色表明發(fā)生了氨的氧化。為了確認(rèn)NO₂^-的生成，可用比色盤進(jìn)行定性測(cè)定。在無菌條件下從試管中吸取0.1 mL液體,放入比色盤凹槽中，先加入1滴重氮試劑，然后加入1滴藕合劑，如果有品紅至紅色出現(xiàn)，表明有NO₂^-存在，并與未接種的對(duì)照比較。

繼續(xù)培養(yǎng)至少6周，每周檢查一次顏色的變化，直到有N0₂^-反應(yīng)的試管數(shù)量在最后兩周不再增加為止。培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，要對(duì)顏色較淺或沒有顏色的試管進(jìn)行NO₂^-的定性檢側(cè)。對(duì)沒有NO₂^-反應(yīng)的試管，要用二苯胺試劑檢測(cè)NO₃^-的含量，因?yàn)閬喯跛嵫趸⑸镉锌赡芤褜O₂^-全部氧化為NO₃^-。硝酸鹽檢測(cè)的靈敏度不如亞硝酸鹽高。

5、結(jié)果計(jì)算

記錄最后檢測(cè)的每個(gè)稀釋度中有NO^2-和NO₃^-反應(yīng)的試管數(shù)，再計(jì)算氮氧化細(xì)菌群體的豐度。

結(jié)果以每克干土的氨氧化細(xì)菌個(gè)數(shù)表示。

五、亞硝酸氧化細(xì)菌的測(cè)定

1、方法原理

亞硝酸氧化細(xì)菌氧化的基質(zhì)是NO₂^-，通過定性檢測(cè)NO₂^-的消失或NO₃^-的生成，最終確定單個(gè)試管中是否有亞硝酸級(jí)化微生物的存在，并用最大可能計(jì)數(shù)法估計(jì)亞硝酸氧化微生物的數(shù)量。

2、試劑

（1）培養(yǎng)基備用液:除用亞硝酸鉀溶液[p(KNO2)=8.5g·L^-1〕取代硫酸銨溶[(NH₄₂SO₄=5.0g·L^-1〕外。

（2）培養(yǎng)基:分別取1.0mL KNO₂溶液、1.0mL CaC1₂·2H₂O溶液、1.0mL MgSO₄7H₂O溶液、4.0mL K₂HPO₄溶液、1.0mL熬合鐵溶液和1.0mL微量元素溶液混合，稀釋至1000mL。每試管中加入4mL該液休培養(yǎng)基，高退滅菌(121⁰C下15 min)。滅菌后培養(yǎng)基的pH為pH7.0～pH7.3。

（3）稀釋劑(磷酸鹽緩沖溶液)和修正后的Gricss-Ilosvay試劑的配制方法相同。

3、操作步驟

對(duì)于亞硝酸氧化細(xì)菌計(jì)數(shù)所用的稀釋度，大體與氨氧化細(xì)菌計(jì)數(shù)所用的相同。試管在25⁰C～30⁰C避光培養(yǎng)21d后，用修正后的Griess-Ilosvay試劑檢測(cè)NO₂^一的存在。在沒有NO₂^—反應(yīng)的試管，表明亞硝酸鹽已經(jīng)發(fā)生了氧化。

4、結(jié)果計(jì)算與表示方法

記錄最后檢側(cè)的每個(gè)稀釋度中有NO₂^一反應(yīng)的試管數(shù)。結(jié)果以每克干土的亞硝酸氧化細(xì)菌個(gè)數(shù)表示。

參考資料：土壤農(nóng)業(yè)化學(xué)分析方法