隨著社會經(jīng)濟的快速發(fā)展，人們的生活水平不斷提高，生活方式發(fā)生了較為深刻的變化。人們飲酒量的需求也在日益增加。與此同時，酒精引起的消化系統(tǒng)問題越來越受到關(guān)注。因此，尋找具有保護胃黏膜功能的生物活性物質(zhì)已成為人類關(guān)注的熱點之一。沙棘甾醇是沙棘油中的天然活性成分之一，是植物生長過程中重要的次生代謝產(chǎn)物，具有多種藥理活性功能。本實驗以沙棘籽油為樣品，采用皂化法提取樣品中的甾醇并對工藝進行優(yōu)化，經(jīng)無水乙醇反復(fù)重結(jié)晶得到純化沙棘甾醇，采用磷硫鐵顯色法測定甾醇含量(總甾醇含量為84.5％)，參考文獻并稍作修改。研究了沙棘甾醇對大鼠急性乙醇型胃黏膜損傷的生化指標(biāo)和病理學(xué)影響，初步闡述了沙棘甾醇對乙醇型胃黏膜損傷的保護作用。

一、材料

1、動物

SPF級SD大鼠112只，雌雄各半，體重160±15g，購自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心，實驗動物許可證號SCXK(陜)2017-003。大鼠自由進食水，明暗周期12h，室溫22-25℃，相對濕度40％～60％。適應(yīng)周期為7d。

2、藥品

采用皂化法提取沙棘籽油甾醇并對工藝進行優(yōu)化，得出最佳皂化工藝條件，經(jīng)氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)檢測鑒定，沙棘籽油甾醇種類有菜油甾醇、△7-燕麥甾烯醇、β-谷甾醇、△5-燕麥甾烯醇4種；40℃烘干備用。

實驗鼠維持飼料：江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責(zé)任公司；鹽酸雷尼替丁膠囊(湖北民康制藥有限公司，規(guī)格：0.15g／粒，國藥準(zhǔn)字：H42021353)；烏拉坦(Adamas試劑有限公司，生產(chǎn)貨號：51-79-6)。

3、試劑

SOD、MDA、GSH-Px試劑盒(南京建成生物工程研究所)；TNF-a、MTL、PEG2、HEX-β、cAMP試劑盒(武漢優(yōu)爾生科技股份有限公司)；橄欖油(天津嘉里糧油有限公司，生產(chǎn)日期：B20171123X)、0.9％生理鹽水(山東齊都藥業(yè)有限公司)、75％乙醇(天津市富宇精細(xì)化工有限公司)。

4、儀器

酶標(biāo)儀(美國ThermoFisher公司)、臺式高速離心機(德國艾本德公司)、數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州國華電器有限公司)、電子分析天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)、加熱磁力攪拌器(德國IKA公司)。

二、方法

1、供試物制備

沙棘甾醇和鹽酸雷尼替丁膠囊在灌胃給藥前，研磨成粉后溶解(懸浮)于橄欖油中，通過加熱磁力攪拌器和超聲處理獲取均質(zhì)的溶液。

2、實驗分組、造模和給藥

實驗前對各組大鼠進行稱量、標(biāo)號并記錄。將大鼠按體重隨機分為正常對照組、模型對照組、橄欖油對照組、鹽酸雷尼替丁組、沙棘甾醇低劑量組、中劑量組和高劑量組，每組16只，雌雄各半。對照組及模型組灌胃生理鹽水，橄欖油組灌胃橄欖油，其余各組按鹽酸雷尼替丁組(50mg·kg^-1·d^-1)、沙棘甾醇低劑量組(100mg·kg^-1·d^-1)、沙棘甾醇中劑量組(200mg·kg^-1·d^-1)和沙棘甾醇高劑量組(400mg·kg^-1·d^-1)給藥。灌胃容積為10mL／kg，每日灌胃1次，連續(xù)給藥7d。實驗前一天禁食不禁水24h。末次空腹給藥2h后，除正常對照組外，其余各組灌胃75％乙醇制備急性胃黏膜損傷模型，各治療組用藥劑量根據(jù)成人量換算動物劑量倍數(shù)簡表計算得出。

三、檢測指標(biāo)

1、胃組織形態(tài)及病理學(xué)檢查

造模2h后，每組隨機選取2只大鼠，20％烏拉坦腹腔注射麻醉。打開大鼠腹腔，結(jié)扎幽門與賁門，取出全胃，用PBS緩沖液沖洗胃內(nèi)雜質(zhì)，剪取大鼠胃組織(0.5cm×O.5cm)置于2.5％戊二醛溶液中做電鏡檢查。經(jīng)固定、組織脫水、浸透包埋，制備半薄切片，在透射電鏡下，甲苯胺藍染色、定位，在10000倍下觀察，隨機CCD相機采集照片。

2、樣品采集

每組剩余14只大鼠均打開腹腔，取出全胃，結(jié)扎幽門與賁門，組織置于-80℃儲存，用于相關(guān)指標(biāo)的測定。橫切一塊胃組織，在冷生理鹽水中漂洗，去除血液，濾紙吸干，稱重；在加入9倍體積的PBS磷酸緩沖鹽溶液，組織勻漿機10000-15000ffmin上下進行研磨，待溶液中無纖維狀物質(zhì)即為勻漿完全，3000r／min離心10min，取上清，即為10％胃組織勻漿液。

3、胃組織抗氧化指標(biāo)測定

利用BCA法測定大鼠胃組織中蛋白的含量。黃嘌呤氧化酶法測定大鼠胃組織中SOD酶活力，采用SOD測定試劑盒(微量法)。取大鼠胃組織勻漿18μL，依次按步驟加入試劑盒中的試劑，充分混勻，室溫靜置30min，于560nm處測OD值，計算各組大鼠胃組織中SOD酶活性。

硫代巴比妥酸法測定大鼠胃組織中MDA含量，采用MDA試劑盒。取待測胃組織勻漿200μL于96孔板中，依次加入試劑盒中的試劑，旋渦混勻器混勻，95℃水浴中保溫30min，置于冰浴中冷卻，1000×g，25℃，離心10min；測定532nm和600nm處的吸光度，記為A532和A600，△A=A532-A600，計算各組大鼠胃組織中MDA含量。

DTNB法測定大鼠胃組織中GSH—Px酶活性，采用GSH-Px試劑盒。取待測胃組勻漿0.2mL，依次加入試劑盒中的試劑，混勻，1700×g，離心10min，取上清液lmL做顯色反應(yīng)，顯色反應(yīng)結(jié)束后，室溫靜置15min，412nm處測得OD值，計算各組大鼠胃組織中GSH-Px酶活力。

4、胃組織中TNF-a、PGE2、HEX-β、cAMP含量的測定

采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法檢測大鼠胃組織勻漿中TNF-a、PGE2、cAMP、HEX-β的含量；取待測勻漿，按試劑盒加樣于96孔板，37℃孵育1小時，吸棄，加檢測溶液A，37℃孵育lh，洗板3次，加檢測溶液B，37℃孵育30min，洗板5次，加TMB底物，37℃孵育15min，加終止液，讀取OD值。

5、數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理及分析，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±S)表示，組間比較采用單因素方差分析(one-wayANOVA)，P＜0.05為有顯著差異。

四、結(jié)果與分析

1、沙棘甾醇對急性損傷大鼠胃組織形態(tài)的影響

取胃組織進行大體形態(tài)觀察，結(jié)果顯示，對照組大鼠胃組織結(jié)構(gòu)完整，大小、形態(tài)正常，胃黏膜清潔。模型對照組表現(xiàn)出明顯的黏膜損傷，出現(xiàn)黑褐色的出血點。沙棘甾醇中、高劑量組和雷尼替丁組的胃黏膜損傷程度與模型組比較均有不同程度的減輕，其中以高劑量效果最好。結(jié)果見圖1。

2、沙棘甾醇對急性損傷大鼠胃組織病理學(xué)的影響

如圖2所示，正常對照組大鼠胃黏膜細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞核圓形，核內(nèi)染色質(zhì)分布基本均勻；細(xì)胞質(zhì)內(nèi)線粒體豐富、嵴短小，細(xì)胞內(nèi)可見較多堆疊排列的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。模型對照組，胃黏膜壁細(xì)胞及主細(xì)胞明顯腫脹，壁細(xì)胞數(shù)量增多、體積較大、核內(nèi)常染色質(zhì)稀疏、線粒體腫脹，部分線粒體嵴溶解、消失，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)減少。陽性藥物鹽酸雷尼替丁組胃黏膜壁細(xì)胞及主細(xì)胞結(jié)果清晰，壁細(xì)胞輕度腫脹，細(xì)胞核圓形，核內(nèi)染色質(zhì)輕度凝集；細(xì)胞質(zhì)內(nèi)線粒體豐富，輕度腫脹。

沙棘甾醇各劑量組隨著劑量的增加，胃黏膜壁細(xì)胞及主細(xì)胞結(jié)構(gòu)逐漸趨于正常，細(xì)胞腫脹度減輕，細(xì)胞核形狀漸轉(zhuǎn)規(guī)則，核內(nèi)染色質(zhì)均勻，線粒體腫脹逐步減輕，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)豐富。
 

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