2)基于磁顆粒數(shù)量變化的MRS?；诖蓬w粒數(shù)量變化的MRS是一種新型的磁弛豫生物傳感分析方法。其基本原理是基于大小不同的磁顆粒在同一磁場中的分離速度的差異，將大粒徑的磁顆粒作為免疫磁分離的載體，小粒徑的磁顆粒作為磁信號探針，通過修飾有給體/受體的載體特異性識別修飾有受體/給體的磁顆粒，經(jīng)磁分離等操作后，使磁探針數(shù)量發(fā)生變化，從而實現(xiàn)生物傳感。相對于基于磁顆粒狀態(tài)改變MRS，該類型傳感器不需要誘導(dǎo)磁顆粒的聚集，有效提高了MRS的穩(wěn)定性。此外，T2信號對磁探針的濃度的改變更為敏感，具有更高的響應(yīng)，有效提高了MRS傳感器的靈敏度。關(guān)于磁顆粒數(shù)量變化介導(dǎo)的MRS生物傳感器的研發(fā)，國內(nèi)外均有此方面的報道。Chen等將磁分離(magneticseparation，MS)與MRS相結(jié)合，構(gòu)建了一種基于磁顆粒數(shù)量變化的MRS生物傳感平臺，并成功應(yīng)用于致病菌與病毒的快速檢測(圖2B)。

該方法主要基于大粒徑磁顆粒(250nm磁顆粒，MNP250)與小粒徑磁顆粒(30nm磁顆粒，MNP30)在小磁場(0.01T)中具有不同的分離速度，MNP250由于具有高飽和磁化強(qiáng)度，能夠在1min內(nèi)被0.01T磁場快速分離，而MNP30由于飽和磁化強(qiáng)度較低，在相同條件下，60min尚不能磁分離完全。Chen等將MNP250作為磁分離的載體并偶聯(lián)捕獲抗體，將MNP30作為磁信號探針并偶聯(lián)檢測抗體，當(dāng)目標(biāo)物存在時，經(jīng)過特異性免疫反應(yīng)能夠形成MNP250G目標(biāo)物GMNP30雙抗夾心結(jié)構(gòu)。由于磁分離速度的不同，可以輕易地將MNP250G目標(biāo)物GMNP30與反應(yīng)體系中未反應(yīng)的MNP30分離，從而獲得未反應(yīng)的MNP30，對其進(jìn)行T2信號測定，實現(xiàn)定量分析。該方法集樣品富集、提取、檢測一步完成，整個免疫分析過程能夠在30min內(nèi)完成，操作簡單，靈敏度高，具有良好的快速檢測的潛力。

此外，2013年，Weissleder課題組基于磁顆粒GDNA探針，結(jié)合分子雜交實驗，構(gòu)建了臨床樣品中致病菌的生物傳感器分析系統(tǒng)(圖2C)。此工作通過RTGPCR技術(shù)對所提取RNA的目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行特異性擴(kuò)增，得到大量的單鏈DNA，此DNA能夠被偶聯(lián)有寡核苷酸捕獲探針的聚合微球所捕獲，得到聚合微球GDNA，聚合微球GDNA進(jìn)而與偶聯(lián)有檢測探針的磁顆粒(MNP)結(jié)合，得到聚合微球GDNAGMNP，由于大量MNP結(jié)合到聚合微球上，可顯著降低周圍水分子的T2值。該方法實現(xiàn)了三步信號擴(kuò)增：(1)PCR擴(kuò)增；(2)聚合微球?qū)δ繕?biāo)核酸分子的捕獲與富集；(3)磁信號擴(kuò)增。該方法穩(wěn)定快速，能夠在2h內(nèi)同時診斷臨床標(biāo)本中的13種細(xì)菌。更重要的是，其課題組所使用的微型核磁共振儀為快速檢測提供了有力的工具。Lu等構(gòu)建了一種基于磁顆粒數(shù)量變化的MRS生物傳感方法，并將其用于微小RNA(MicroRNA，miRNA)的高靈敏定量分析(圖2D)。

miRNA是一種小的、非編碼的RNA分子，由大約22個核苷酸組成，參與基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄和調(diào)控。miRNA的異常表達(dá)可能導(dǎo)致DNA擴(kuò)增或易位，導(dǎo)致腫瘤增生或轉(zhuǎn)移，其快速準(zhǔn)確檢測能夠為臨床診斷及癌癥治療提供重要的參考依據(jù)。此工作組裝了一種“大磁顆粒GDNAG小磁顆粒”(MM1000GDNAGMN30)磁探針，當(dāng)目標(biāo)miRNA存在時，雙鏈特異性核酸酶(DSN)能夠特異性切割通過雜交生成的DNAGRNA異源雙鏈核酸分子，從而引導(dǎo)miRNA和MN30的釋放，釋放的MN30通過不同粒徑磁顆粒分離速度的不同與磁探針進(jìn)行分離，最后對上清液中MN30的進(jìn)行定量分析。與傳統(tǒng)MRS相比，此方法能夠在目標(biāo)物存在的情況下，直接釋放MN30，并將其作為信號源進(jìn)行信號讀出，是一種信號打開的方式，穩(wěn)定性良好。此外，釋放的miRNA又可以作為目標(biāo)物進(jìn)行新一輪的雜交反應(yīng)，釋放MN30，使得信號放大，顯著提高傳感方法的靈敏度，能夠?qū)崿F(xiàn)尿液樣品中miRG21高靈敏的一步檢測(5fM)，在臨床即時診斷方向具有良好的應(yīng)用前景。。

3)磁顆粒狀態(tài)與數(shù)量同時變化的MRS。在檢測農(nóng)獸藥殘留等小分子有害物質(zhì)時，農(nóng)獸藥小分子通常只有一個可以和抗體特異性結(jié)合的位點，引起的磁信號改變微弱，導(dǎo)致傳統(tǒng)MRS靈敏度無法對小分子目標(biāo)物實現(xiàn)痕量檢測。為了解決此問題，Zheng等構(gòu)建了一種基于生物正交反應(yīng)進(jìn)行信號級聯(lián)放大，集磁顆粒狀態(tài)與數(shù)量變化于一體的MRS傳感平臺，并將其用于農(nóng)藥殘留毒死蜱的痕量分析。毒死蜱因其廣譜性，已成為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中廣泛使用的有機(jī)磷殺蟲劑。然而，長期接觸有機(jī)磷農(nóng)藥會對人體神經(jīng)系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)造成損害，對人體健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅。在本方法中，毒死蜱分子會與MNP1000GBSAG毒死蜱競爭性結(jié)合二苯并環(huán)辛炔(DBCO)修飾的單克隆抗體(AbGDBCO)，得到的“MNP1000GBSAG毒死蜱GAbGDBCO”復(fù)合物上具有多個DBCO位點，能夠捕獲大量的azideGMNP30(DBCO能夠與疊氮化物(azide)發(fā)生生物正交反應(yīng))，通過磁分離效率的不同可得到未反應(yīng)的azideGMNP30(磁顆粒數(shù)量變化)，通過加入生物交聯(lián)劑DBCOGPEG4GDBCO進(jìn)一步誘導(dǎo)DBCO和疊氮化物基團(tuán)之間的生物正交反應(yīng)使分散的azideGMNP30聚集(磁顆粒狀態(tài)變化)。試驗結(jié)果表明，該傳感器能夠?qū)崿F(xiàn)對毒死蜱0.1~1000ng/mL的定量檢測，檢出限為0.05ng/mL。該傳感器的高效與高靈敏主要得益于：

(1)疊氮化物與DBCO的生物正交反應(yīng)具有快速、高選擇性的特點，是實現(xiàn)信號放大而不引入交叉反應(yīng)的重要手段，特別是在復(fù)雜樣品中；

(2)單一抗體對azideGMNP30顯示出多個DBCO位點，這將增大由單個靶標(biāo)誘導(dǎo)MNP30的結(jié)合量，從而使信號放大；

(3)生物交聯(lián)劑DBCOGPEG4GDBGCO誘導(dǎo)的azideGMNP30聚集，使傳感信號進(jìn)一步放大。該傳感器通過生物正交反應(yīng)將MNPs數(shù)量變化引起的信號放大與MNPs狀態(tài)變化引起的信號放大有機(jī)結(jié)合起來，實現(xiàn)磁信號的級聯(lián)放大，有效提高了生物傳感器的靈敏度和檢測范圍。

Wu等利用堿性磷酸酶介導(dǎo)的點擊化學(xué)反應(yīng)作為信號轉(zhuǎn)化與放大系統(tǒng)，構(gòu)建了雙重模式的MRS生物傳感器。該工作通過Cu＋催化疊氮化物和炔的1，3G偶極環(huán)加成的點擊化學(xué)反應(yīng)(CuAAC)誘導(dǎo)磁顆粒的狀態(tài)變化或調(diào)節(jié)磁探針數(shù)量變化。如圖2E所示，當(dāng)小分子目標(biāo)物存在時，包被在96孔板上的目標(biāo)物GBSA能夠與目標(biāo)物競爭性結(jié)合單克隆抗體(Ab)，洗滌并加入堿性磷酸酶(ALP)標(biāo)記的羊抗小鼠IgG，可得到與目標(biāo)物成反比的“BSAG目標(biāo)物GAbGIgG(ALP)”。ALP能夠?qū)⒘姿峄箟难?AAP)去磷酸化，生成具有還原性的抗壞血酸(AA)，能夠?qū)u2＋還原為Cu＋，進(jìn)而用于CuAAC點擊化學(xué)反應(yīng)，使修飾有疊氮分子(azide)的磁顆粒與修飾有炔分子(alkyne)的磁顆粒聚集。

該MRS生物傳感器分為兩種模式(aMRS和nMRS)：aMRS模式是基于MNP30Gazide與MNP30Galkyne經(jīng)CuAAC催化變?yōu)榫奂癄顟B(tài)，產(chǎn)生T2信號變化；nMRS是基于MNP30Gazide與MNP1000Galkyne經(jīng)CuAAC催化變?yōu)榫奂癄顟B(tài)，進(jìn)而通過磁分離得到未反應(yīng)的MNP30Gazide(磁分離速度不同)，并對其進(jìn)行T2信號讀出，此模式是基于磁顆粒數(shù)量的變化。研究結(jié)果表明，該傳感器能夠?qū)崿F(xiàn)食品基質(zhì)中獸藥殘留的快速高靈敏檢測，其線性檢測范圍為0.1~500ng/mL，檢出限為0.02ng/mL，并且所提供的雙模式分析有效拓寬了該生物傳感器的適用性與實用性，為食品安全領(lǐng)域中農(nóng)獸藥殘留及其他領(lǐng)域中有害小分子的快速檢測提供了有力的工具。

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