乳制品是非常重要的營養(yǎng)補充，是日常飲食的重要組成部分，對增強國民身體素質(zhì)具有重要的意義，尤其是嬰幼兒乳粉作為嬰幼兒階段的主要營養(yǎng)來源，更是人們關(guān)注的重點。香蘭素和乙基香蘭素具有強烈的奶香味，麥芽酚和乙基麥芽酚是廣譜香味增效劑，此四種香料廣泛用于各種具有奶香味的食品中。乳制品中添加食用香精香料可以提高食品的風味，但長期食用添加香精的奶粉可能使新生兒對其產(chǎn)生依賴性，過量攝入會引發(fā)潛在的健康問題，因此香精香料的超范圍及過量使用問題日益引起人們的關(guān)注。國家衛(wèi)計委發(fā)布實施的GB2760-2014《食品添加劑使用標準》中明確指出不得添加食用香料、香精有27種食品，其中包括巴氏殺菌乳、滅菌乳、發(fā)酵乳、無水黃油、稀奶油和嬰幼兒配方乳粉等多種乳制品。因此，建立靈敏度高、準確可靠的乳制品中4種常用香料的檢測方法對乳制品質(zhì)量安全監(jiān)管具有重要意義。

目前，此四種化合物同時檢測的方法主要有分光光度法，高效液相色譜法，二維液相色譜法，氣相色譜-質(zhì)譜法，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法等。其中，分光光度法和液相色譜法檢測限較高，多種乳制品中要求不得添加食用香精，較高的檢測限可能會導(dǎo)致低含量的添加樣品無法檢出；氣相色譜-質(zhì)譜法分析時間較長；液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法具有靈敏度高、特異性強、分析速度快等優(yōu)點，廣泛應(yīng)用于食品中香料物質(zhì)的檢測。然而，在LCMS/MS分析中，基質(zhì)效應(yīng)嚴重影響定量分析的準確度和精密度，目前文獻報道LC-MS/MS測定乳粉中四種常用香料化合物均存在較強的基質(zhì)效應(yīng)，需采用基質(zhì)匹配曲線或者內(nèi)標法進行定量分析，大大增加了檢測成本，此外，前處理過程需要對凈化液進行濃縮，而揮發(fā)性較強的香料化合物在濃縮過程中易損失。受酚類化合物可采用酸堿分配法凈化的啟發(fā)，本文采用水-醚體系對乳制品樣品進行提取，經(jīng)堿液反萃除去雜質(zhì)后采用高靈敏度高選擇性的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析四種化合物。通過研究不同比例堿醚比的堿液反萃醚相中的香料化合物，實現(xiàn)樣品凈化和富集同步進行，整個過程無需氮吹濃縮，避免揮發(fā)性較強的香料化合物在氮吹濃縮過程中損失，以期建立一種靈敏度高、簡便快捷、準確可靠的乳制品中四種常用香料的檢測方法，為相關(guān)部門建立相關(guān)測定標準提供參考，保障乳制品的質(zhì)量安全。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甲醇、乙腈、叔丁基甲醚　色譜純，美國TEDIA公司；甲酸　色譜純，德國CNW公司；鹽酸、氫氧化鈉、氨水、無水硫酸鈉分析純，廣州化學試劑廠；麥芽酚（純度≥99%）、乙基麥芽酚（純度≥99%）、香蘭素（純度≥98%）、乙基香蘭素（純度≥98%）美國Sigma公司；乳制品樣品（包括嬰幼兒配方乳粉、煉奶、黃油、奶酪、鮮牛奶、純牛奶、稀奶油、酸奶等共15份）均購自?？谑斜镜卮笮统?。

色譜柱：HSST3色譜柱（100mm×2.1mm，2.5μm）、BEHC18色譜柱（100mm×2.1mm，1.7μm）、HLB固相萃取柱（100mg，3mL）、TQD超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國Waters公司；PXA固相萃取柱，（150mg，6mL）迪馬公司；KQ3200DE超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；MS3渦旋儀，德國IKA公司；320R低溫離心機，德國Hettich公司；AdvantageA10超純水凈化儀，美國Millipore公司；GenevacEZ-2型溶劑蒸發(fā)工作站，英國SPScientific公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品前處理

奶粉、奶酪、煉奶、黃油等類固體乳制品：稱取2g試樣（精確至0.01g），置于50mL聚丙烯離心管中，加入5mL50℃的水（黃油樣品置于100℃烘箱中加熱使之溶解，煉奶用4mL水溶解），3000r/min渦旋混勻2min，40℃下超聲提取15min，超聲頻率為37kHz，再加入20mL叔丁基甲醚，3000r/min渦旋混勻3min，再加入10g無水硫酸鈉除水，3000r/min渦旋混勻2min，9000r/min離心3min，吸取上清液10mL轉(zhuǎn)移至另一離心管中，再加入2mL0.2mol/L氫氧化鈉溶液反萃，3000r/min渦旋混勻1min后，3000r/min離心3min，用移液器準確移取下層清液0.9mL至刻度試管中，加甲酸定容至1.0mL過0.22μm微孔濾膜，供液相色譜-質(zhì)譜測定。

過柱凈化富集過程：吸取上清液5mL轉(zhuǎn)移至另一離心管，加入5mL0.2mol/L氫氧化鈉溶液反萃，去掉上清液，40℃下用GenevacEZ2溶劑蒸發(fā)工作站濃縮20min，除去微量的叔丁基甲醚。

HLB過柱方法：除醚后用鹽酸調(diào)節(jié)pH至3.0，先后加入3mL甲醇，3mL超純水活化固相萃取柱，然后全部上樣，樣液體積約為4.5mL，重力過柱后，用5mL純水淋洗，棄去淋洗液，接著用5mL注射器抽干，最后用1mL甲醇洗脫。

PXA過柱方法：先后加入3mL甲醇，3mL超純水活化固相萃取柱，然后全部上樣，樣液體積約為4.5mL，重力過柱后，分別用3mL5%氨水甲醇和3mL甲醇淋洗，抽干，最后用1mL5%甲酸甲醇洗脫。

巴氏殺菌乳、滅菌乳、發(fā)酵乳、稀奶油等液體乳制品，直接稱取5g試樣于50mL聚丙烯離心管中，再加入20mL叔丁基甲醚提取，后處理步驟同奶粉等樣品。

1.2.2 色譜-質(zhì)譜條件　

色譜柱：HSST3色譜柱（100mm×2.1mm，2.5μm，Waters）；流速：0.4mL/min；進樣體積：3μL；柱溫：30℃；流動相，A相為甲醇，B相為0.05%甲酸水，梯度洗脫程序為0～1.0min，10%～25%A，1.0～5.0min，25%A，5.0～5.1min，25%～60%A，5.1～6.0min，60%A，6.0～6.1min，60%～90%A，6.1～7.0min，90%A，7.0～7.1min，90%～10%A，7.1～8.0min，10%AMS條件：電噴霧正離子源（ESI+），毛細管電壓：3.0kV，離子源溫度：150℃，脫溶劑管溫度：350℃，霧化氣：150L/hr氮氣，干燥氣：650L/hr氮氣，碰撞氣：氬氣。掃描模式：多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM），帶星號離子為定量離子。

1.3 數(shù)據(jù)處理

通過Masslynx工作站及數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)采集分析質(zhì)譜圖，外標法定量。試驗結(jié)果采用平均值表示，每個試驗平行三次，采用Excel2010進行數(shù)據(jù)處理。

相關(guān)鏈接：叔丁基甲醚，麥芽酚，香蘭素，乙基麥芽酚

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