乳酸菌是一類GRAS（GenerallyRegardedAsSafety）級食品微生物，已廣泛應用于發(fā)酵食品，可發(fā)揮抗菌、防腐，賦予食品特殊風味以及提高營養(yǎng)品質(zhì)等功能。目前，用于生產(chǎn)發(fā)酵食品的乳酸菌大概有20余種，如：保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌用于生產(chǎn)酸奶，德式乳桿菌用于發(fā)酵畜產(chǎn)品，干酪乳桿菌、副干酪乳桿菌用于生產(chǎn)乳酪等，植物乳桿菌是酸菜發(fā)酵生產(chǎn)中的優(yōu)勢菌株。以上這些傳統(tǒng)的乳酸菌發(fā)酵食品各自具有獨特的風味，深受消費者青睞。

豆?jié){是一類通常以大豆為原材料制成的傳統(tǒng)植物蛋白飲料，在豆?jié){的基礎上經(jīng)乳酸菌等菌株發(fā)酵可制成發(fā)酵豆?jié){。與傳統(tǒng)豆?jié){相比，發(fā)酵豆?jié){中的大豆蛋白能被分解為氨基酸和寡肽，更易于人體的吸收，同時破壞豆?jié){中的凝血素、胰蛋白酶抑制劑、脹氣因子等抗營養(yǎng)因子。此外，經(jīng)乳酸菌發(fā)酵，發(fā)酵豆?jié){被重新賦予新的風味。其中，揮發(fā)性香氣成分的增加或生成是發(fā)酵豆?jié){提升感官品質(zhì)的重要因素。固相微萃取技術(shù)（SPME）是一種無溶劑樣品前處理技術(shù)，具有高效、便捷、操作簡單等特點，與GC-MS技術(shù)相結(jié)合被廣泛應用于發(fā)酵食品中揮發(fā)性氣味物質(zhì)的定性、定量分析。相關(guān)研究已有大量報道。樊艷等采用基于電子舌與SPME-GC-MS技術(shù)檢測分析了腐乳中的風味物質(zhì)；王丹等采用SPME-GC-MS技術(shù)分析嗜熱鏈球菌IMAU10638發(fā)酵乳貯藏期間的揮發(fā)性風味物質(zhì)變化；馬艷麗等基于SPME-GC-MS技術(shù)比較4種傳統(tǒng)中式酸凝奶酪與西方切達奶酪中揮發(fā)性風味組分的差別。基于SPME-GC-MS技術(shù)分析發(fā)酵食品中特征性風味物質(zhì)的組成及產(chǎn)生規(guī)律，對傳統(tǒng)發(fā)酵食品的品質(zhì)調(diào)控和改善具有重要意義。

目前，針對乳酸菌發(fā)酵豆?jié){揮發(fā)性氣味物質(zhì)組成和特征香氣物質(zhì)分析的研究較少。本研究選擇在發(fā)酵食品中應用廣泛的5種乳酸菌：植物乳桿菌（Lactobacillusplantarum）、干酪乳桿菌（Lac-tobacilluscasei）、德式乳桿菌（Lactobacillusger-mani）、發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillusfermentum）和嗜熱鏈球菌（Streptococcusthermophilus）生產(chǎn)發(fā)酵豆?jié){，并對不同乳酸菌發(fā)酵豆?jié){揮發(fā)性氣味物質(zhì)的組成與差異性進行分析，旨在為乳酸菌發(fā)酵豆?jié){飲料的開發(fā)與生產(chǎn)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豆?jié){粉購于永和食品（中國）股份有限公司；純凈水，華潤怡寶飲料（中國）有限公司；2-辛醇（分析純），美國Sigma-Aldrich公司；植物乳桿菌FZU122、干酪乳桿菌FJAT-7928、德式乳桿菌FJAT-46740、發(fā)酵乳桿菌FJAT-46744、嗜熱鏈球菌FJAT-46738，福州大學生物科學與工程學院保藏。

1.2 培養(yǎng)基的配制

MRS培養(yǎng)基：分別稱取牛肉膏10g、葡萄糖20g、酵母提取物5g、蛋白胨10g、磷酸氫鉀2g、無水乙酸鈉5g、硫酸錳0.25g、檸檬酸氫二銨2g、吐溫-801mL、硫酸鎂0.5g溶解于1000mL蒸餾水中，調(diào)pH值至6.2，121℃高壓滅菌20min。生理鹽水：稱取8～9gNaCl固體，溶解于1000mL去離子水中，121℃高壓滅菌20min。

1.3 儀器與設備

紫外-可見分光光度計（UV-1100型），上海美普達儀器有限公司；數(shù)顯pH計（MP511），上海三信儀表廠；氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（5977A），美國安捷倫科技有限公司；固相微萃取萃取頭，PDMS30μm，美國Supelco公司；SPME手動進樣柄（57330-U），美國Supelco公司；恒溫生化培養(yǎng)箱（SPX-150BIII），黃驊菲斯福實驗儀器有限公司；立式高壓滅菌鍋（LDZF-50L-III），上海申安醫(yī)療器械廠；理化分析型超純水機（WP-UP-LH-20），四川沃特爾水處理設備有限公司；分析電子天平（HZK-FA2105），美國康州HZ電子科技有限公司；高速冷凍離心機（Fresco17），賽默飛世爾科技（中國）有限公司；電磁攪拌器（OMS-181E），上海歐河機械設備有限公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 豆?jié){的制備

稱取一定量豆?jié){粉，以10%的比例（質(zhì)量比）溶解于純凈水，充分攪拌均勻，分裝至200mL絲口瓶，121℃高壓滅菌20min，待用。

1.4.2 菌株活化與接種

5種乳酸菌包括：植物乳桿菌FZU122、干酪乳桿菌FJAT-7928、德式乳桿菌FJAT-46740、發(fā)酵乳桿菌FJAT-46744、嗜熱鏈球菌FJAT-46738，由甘油管分別接種至MRS液體培養(yǎng)基37℃靜置培養(yǎng)，經(jīng)活化、轉(zhuǎn)接培養(yǎng)后，取一定量菌液離心，去除上清液，用生理鹽水洗滌3次。以生理鹽水作參比溶液，將菌液吸光度（OD_600nm）調(diào)至0.5～0.6。分別以1%的接菌量接種至100mL無菌豆?jié){，每個試驗組設立3個平行樣，同時設立未發(fā)酵豆?jié){對照組，置恒溫生化培養(yǎng)箱37℃條件下靜置發(fā)酵60h。

1.4.3 pH值的測定

MRS液體培養(yǎng)基和豆?jié){經(jīng)不同乳酸菌發(fā)酵后，取樣，用pH計測定不同乳酸菌發(fā)酵樣品的pH值，每個試驗組設3個平行樣。1.4.4頂空固相微萃取取5mL樣品置12mL頂空萃取瓶中，加入1gNaCl、磁力轉(zhuǎn)子和10μL2-辛醇（10mg/L，內(nèi)標物），用密封墊迅速密封樣品瓶，置磁力攪拌器加熱臺上，攪拌速度600r/min，40℃水浴溫育20min后插入固相微萃取針，壓出萃取纖維，使其固定在距離液面0.5～1.0cm處，吸附萃取30min后收回萃取纖維，拔出萃取針，插入氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀中進樣分析。

1.4.4 頂空固相微萃取

取5mL樣品置12mL頂空萃取瓶中，加入1gNaCl、磁力轉(zhuǎn)子和10μL2-辛醇（10mg/L，內(nèi)標物），用密封墊迅速密封樣品瓶，置磁力攪拌器加熱臺上，攪拌速度600r/min，40℃水浴溫育20min后插入固相微萃取針，壓出萃取纖維，使其固定在距離液面0.5～1.0cm處，吸附萃取30min后收回萃取纖維，拔出萃取針，插入氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀中進樣分析。

1.4.5 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析

氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用分析條件：采用DB-WAX色譜柱（30m×0.25mm，0.25μm），進樣口溫度250℃；柱溫箱起始溫度40℃，保留8min，然后以4℃/min升溫至150℃，再以20℃/min升溫至250℃，保留5min；不分流進樣，載氣為99.999%高純度氦氣，載氣流速1mL/min。質(zhì)譜條件：離子源溫度230℃，電離方式為EI，電離能量70eV，接口溫度250℃，四級桿溫度150℃，選擇SCAN模式為掃描方式，定性分析，離子碎片的掃描范圍為30～500m/z，溶劑延遲時間2.5min。

1.4.6 揮發(fā)性成分的定量分析

選擇匹配度≥70，采用內(nèi)標法定量分析。將10μL質(zhì)量濃度為10mg/mL的2-辛醇和5mL待測樣品混合均勻，對含有內(nèi)標物的樣品通過GC-MS進行分析。根據(jù)待測樣品和內(nèi)標物的峰面積，計算待測組分在樣品中的含量。

揮發(fā)性成分含量（mg/L）=

1.4.7 數(shù)據(jù)處理分析

運用SPSS19.0統(tǒng)計分析軟件處理試驗數(shù)據(jù)，采用STAMP軟件比較組間物質(zhì)差異，利用Heml軟件繪制熱圖，應用SIMCA14.1軟件進行主成分分析，使用Origin8.5軟件和GraphPad6軟件繪圖。試驗數(shù)據(jù)為3次測定的平均值。

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相關(guān)鏈接：硫酸鎂，磷酸氫鉀，德式乳桿菌，硫酸錳