副溶血性弧菌是一種嗜鹽性弧菌，屬于革蘭氏陰性短桿菌，該菌大多存在于近海岸的貝類和海水魚類等水產(chǎn)品中，有時也會出現(xiàn)在腌漬食品中，是世界上沿海地區(qū)引起食物中毒主要的食源性致病菌之一。據(jù)估計，每年約有7600萬人患病，5000人死于食源性疾病。其中很大一部分歸因于沙門氏菌和副溶血性弧菌。副溶血性弧菌最早是在1950年日本的一次由沙丁魚引起的大規(guī)模食物中毒事件中發(fā)現(xiàn)的，之后逐漸在各國的沿海地區(qū)發(fā)現(xiàn)，并持續(xù)至今，已超過沙門氏菌成為世界食源性致病菌之首。其感染途徑主要是食用未完全煮熟的海鮮類食品，進而導(dǎo)致急性胃腸炎，甚至?xí)谷怂劳觥Ｍ瑫r，副溶血性弧菌也是水生動物弧菌病爆發(fā)的病原體，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失。深入研究副溶血性弧菌的防控技術(shù)，對促進水產(chǎn)品的食用安全和海洋經(jīng)濟發(fā)展具有雙重意義。

由于在臨床治療和水產(chǎn)養(yǎng)殖系統(tǒng)中廣泛使用抗菌劑，副溶血性弧菌中耐藥株的流行日益加劇，50％的臨床和環(huán)境分離株具有耐多藥性。自1968年喹諾酮類藥物問世以來，臨床上一直未引入有效對抗革蘭氏陰性菌的新型抗生素同。細(xì)菌對現(xiàn)有抗生素已進化出多種對抗機制，如通過主動外排系統(tǒng)增強藥物的外排作用，產(chǎn)生口一內(nèi)酰胺酶使藥物失去活性，或?qū)⑺幬镒饔玫陌悬c加以修飾或改變等等，急需尋找具有新的作用位點且安全有效的替代防治策略。

革蘭氏陰性菌之所以很難找到有效的抑制藥物，主要是因為其細(xì)胞的包膜結(jié)構(gòu)較復(fù)雜。具有雙層膜結(jié)構(gòu)(位于內(nèi)側(cè)的細(xì)胞質(zhì)膜稱為內(nèi)膜，細(xì)胞壁最外層的膜稱為外膜)。在兩層膜間為肽聚糖層。與外膜共同構(gòu)成細(xì)胞壁。外膜是革蘭氏陰性菌的特有構(gòu)造，具有典型的不對稱性磷脂雙層結(jié)構(gòu)，由脂多糖、磷脂和外膜蛋白構(gòu)成。一直以來，細(xì)胞與外界環(huán)境的物質(zhì)交換部位主要關(guān)注的是細(xì)胞質(zhì)膜，近10年間研究人員才開始關(guān)注外膜，尤其是外膜蛋白在物質(zhì)穿膜過程中的作用。外膜蛋白包括連接外膜層與肽聚糖層的脂蛋白和跨外膜的孔蛋白。單體孔蛋白由8～22個偶數(shù)跨膜鏈以反向平行方式通過相鄰鏈間的氫鍵作用形成β-桶狀結(jié)構(gòu)?？缒ゆ湹臄?shù)量決定孔蛋白的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致孔徑的不同?？椎鞍卓梢赃x擇性地吸收各種營養(yǎng)物質(zhì)，同時也能阻攔多種有害大分子物質(zhì)進入細(xì)胞。在去掉細(xì)胞壁的大腸桿菌原生質(zhì)體中，胞內(nèi)高積累化合物與胞內(nèi)低積累化合物之間的積累差異明顯變小，這一結(jié)果證實外膜是小分子在革蘭氏陰性菌中化合物積累的主要障礙啊。吳賢斌等曾將大腸桿菌外膜孔蛋白OmpW去除，發(fā)現(xiàn)缺失株對硫酸新霉素和氨芐青霉素的敏感性明顯增加。與親本株相比，在大腸桿菌孔蛋白OmpF/OmpC缺失株中觀察到高積累藥物積累量顯著降低。說明小分子穿過外膜主要通過孔蛋白同。以上研究結(jié)果均顯示，細(xì)胞壁尤其是外膜對于革蘭氏陰性菌的生存是必不可少的，而去除細(xì)胞壁或是外膜對于革蘭氏陰性菌可能是致命的。

肉桂醇是我國《食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》中允許使用的食品香料。被證實對革蘭氏陽性菌和陰性菌均有抑菌效果

Mazzarrino等針對腸炎沙門氏菌和單增李斯特菌篩選出21種有抑菌活性的精油，發(fā)現(xiàn)肉桂的抑菌效果是有效的。目前關(guān)于肉桂醇對副溶血性弧菌的抑制作用及機理的研究尚未見報道，本文采用肉桂醇作為抑菌劑探究細(xì)胞壁的缺失對副溶血性弧菌生物學(xué)特性的影響。明確肉桂醇的作用靶點，為副溶血性弧菌的防控提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株、培養(yǎng)基和試劑

副溶血性弧菌保存于-80℃超低溫冰箱中。

3％氯化鈉堿性蛋白胨水(APW)、營養(yǎng)瓊脂，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。以上培養(yǎng)基均121℃滅菌20min。
肉桂醇、Tris、EDTA、硫酸粘桿菌素、十二烷基肌氨酸鈉(SLS)、SYBRGreenI、PI，生工生物工程(上海)股份有限公司；溶菌酶、馬來酸鹽，合肥博美生物科技有限責(zé)任公司：考馬斯亮藍(lán)G-250。天津市福晨化學(xué)試劑廠；蔗糖、氯化鎂、磷酸二氫鉀、乙醇，天津市天力化學(xué)試劑有限公司；磷酸、氫氧化鈉、無水碳酸鈉、氯化鈉、碳酸氫鈉，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司：常用藥敏試紙，杭州濱和微生物試劑有限公司；牛血清蛋白，北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器、設(shè)備

ZD-85A氣浴恒溫振蕩器，金壇市科析儀器有限公司；真空干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；G154DS型自動蒸汽壓力滅菌鍋，廈門致徽儀器有限公司；5804R高速冷凍離心機，Eppendorf中國有限公司；Czone5F自動菌落計數(shù)儀，杭州迅數(shù)科技有限公司；perkinelmerv3酶標(biāo)儀，成都必成豐瑞生物技術(shù)有限公司：UV-2550紫外-可見分光光度計。日本島津公司：Scientz-IID超聲波細(xì)胞粉碎機。寧波新芝生物科技股份有限公司；SDS電泳系統(tǒng)、GelDocXR+凝膠成像儀，美國BIO-RAD有限公司；AccuriC6Plus流式細(xì)胞儀，BD生物科學(xué)北京卓越中心。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌體活化及原生質(zhì)體制備

將副溶血性弧菌按1％的接種量加入APW中。37℃、130r/min培養(yǎng)12h，連續(xù)培養(yǎng)2代。

參考Xu等的方法制備副溶血性弧菌原生質(zhì)體。將活化的菌液置于4℃、6000r/min離心收集菌體細(xì)胞。用0.01mol/LTris-Hcl(pH7.0)洗滌3次。細(xì)胞重懸于含有0.5mol/L蔗糖的0.01mol/LTris-Hcl(pH7.0)中，緩慢加入EDTA溶液(pH8.0。20min之內(nèi)完成此步)至其終濃度為0.01mol，L。37℃、100r/min振蕩20min，獲得一組除去外膜層的細(xì)菌細(xì)胞，留此階段部分菌體冷藏備用。另一部分菌體在4℃、3000r/min離心收集細(xì)胞，用SMM緩沖劑(20mmol/L馬來酸鹽、0.5mol/L蔗糖、20mmol/LMgCl2，pH6.5)清洗2次，細(xì)胞重懸于SMM緩沖劑(含1mg，mL溶菌酶)中，37℃、100r/min振蕩30min，除去肽聚糖層，緩慢滴加EDTA溶液(pH8.0)使其終濃度為0.01mol/L，放入37℃的培養(yǎng)箱溫育15min。獲得一組去壁的細(xì)菌細(xì)胞，將此原生質(zhì)體冷藏備用。未處理的菌體同樣冷藏備用。

1.3.2 最小抑菌濃度測定

采用二倍稀釋法處理肉桂醇原液(質(zhì)量濃度為1g/mL)，使其質(zhì)量濃度依次為原液的1/2至1/2048。試管內(nèi)物質(zhì)組成為8.9mLAPW、1mL菌液(分別為UG、OMDG和CWDG)和0.1mL不同質(zhì)量濃度的肉桂醇溶液。所有試管置于37℃培養(yǎng)24h后觀察菌體生長情況，使培養(yǎng)液保持澄清的最小藥物質(zhì)量濃度即為肉桂醇對副溶血性弧菌的最小抑菌濃度(MIC)。

1.3.3 細(xì)胞膜完整性測定

參考張贊彬等的方法，將菌懸液在4℃、3000r/min條件下離心15min收集菌體，磷酸緩沖液(pH7.0)清洗并重懸。向新的離心管中加入10mL菌懸液和45仙L肉桂醇(1/4MIC、1/2MIC、MIC、空白)，37℃培養(yǎng)6h，在6000r/min下離心3min收集上清液。在波長260nm處測定其吸光度值，即為菌液中核酸的含量。同時采用考馬斯亮藍(lán)法對上清液中的蛋白質(zhì)進行染色，測定其在波長280nm處的吸光度值，即為菌液中蛋白質(zhì)的含量。

1.3.4 硫酸粘桿菌素試驗

考Richter等的方法并適當(dāng)修改，先向96孔板每孔中加入20μL硫酸粘桿菌素溶液(6μmol/L)和178μL稀釋好的菌懸液，靜置30min，再加入不同質(zhì)量濃度的肉桂醇(1/4MIC、1/2MIC、MIC、空白)2μL，混勻并置于37℃培養(yǎng)18～24h后用酶標(biāo)儀測定其在波長280nm處的吸光度值。

1.3.5 外膜蛋白的提取及質(zhì)量濃度測定

參考Chiu等的方法進行外膜蛋白的提取，并稍作修改。在4000r/min、4℃條件下收集細(xì)胞，經(jīng)4℃生理鹽水洗滌3次。重懸于少量體積的鹽水中。利用超聲波細(xì)胞粉碎機進行細(xì)胞破碎處理(300W、冰浴5min)，間歇10次完成。在5000r/min、4℃條件下離心20min，收集上清：于15000r/min離心40min，沉淀重懸于2g/100mLSLS中并在室溫條件下孵育1h后，于15000r/min離心40min，沉淀即為外膜蛋白。

利用考馬斯亮藍(lán)法(Bradford法)測定獲得的外膜蛋白質(zhì)量濃度。首先利用標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1所示。測定波長595nm處外膜蛋白樣品的吸光度值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線公式計算出外膜蛋白的質(zhì)量濃度。

1.3.6 外膜蛋白SDS-PAGE

采用非連續(xù)緩沖系統(tǒng)垂直板電泳，選用12％分離膠，5％濃縮膠。外膜蛋白樣品沸水浴5min，加樣量為20μL[16μL蛋白溶液+4μL(5×)蛋白上樣緩沖液]，80V電壓進行樣品濃縮，樣品進入分離膠后加壓至120V，當(dāng)溴酚藍(lán)即將跑出膠板時，停止電泳。膠板考馬斯亮藍(lán)染色后置于凝膠成像系統(tǒng)拍照。

1.3.7 外膜蛋白競爭試驗

考Lam等的方法進行外膜蛋白競爭試驗，并作一定的改動。將50μL肉桂醇、50μL外膜蛋白(質(zhì)量濃度在2～512μg/mL)加入96孔板中，37℃下孵育1h。之后向每孔中加入100μL副溶血性弧菌懸液(約2.5×106個/mL。使肉桂醇終質(zhì)量濃度為1/2MIC)，37℃下孵育2h。各孔中取出50μL混合培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)移至第2個96孔板中，并加入100μL鹽水和染料混合物(即含有0.1％SYBRGreenI和0.1％PI的鹽水)，用流式細(xì)胞儀分析第2個96孔板中的各孔，確定細(xì)胞凋亡情況。

1.3.8 藥敏試驗

參考李莉等的方法，向100mL營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中分別加入500μL處理好的菌液(包括UG、OMDG、CWDG)，混勻后倒平板，待培養(yǎng)基凝固后向每個平板中放入3片相同的藥敏試紙(包括四環(huán)素、紅霉素、萬古霉素、環(huán)丙沙星、利福平)，所有平板置于37℃培養(yǎng)18～24h，測量抑菌圈直徑。

1.3.9 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)處理采用Excel2010并繪制圖表，利用SPSS19.0對所有數(shù)據(jù)進行差異顯著性分析，所有試驗均重復(fù)測定3次，測定結(jié)果表示為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差。

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