2.3 重組菌全細(xì)胞轉(zhuǎn)化制備GABA的工藝優(yōu)化

2.3.1 溫度對重組菌全細(xì)胞轉(zhuǎn)化生產(chǎn)CABA的影響

酶法制備GABA是一個不可逆反應(yīng)，適宜的溫度可以使GABA轉(zhuǎn)化率達(dá)到最大，所以通過設(shè)置不同的酶轉(zhuǎn)化溫度來探究溫度對GABA轉(zhuǎn)化率的影響。以100g/L的谷氨酸為底物，溶于去離子水中，加入濕菌體(在55℃水浴鍋預(yù)處理50min，改善細(xì)胞膜的通透性)30U/g，在150r/min的水浴搖床中進(jìn)行轉(zhuǎn)化，反應(yīng)過程中，控制pH為5.0。溫度梯度設(shè)置為25、30、35、40、45、50℃，反應(yīng)24h后終止反應(yīng)并進(jìn)行煮沸處理，12000r/min離心5min得上清液，適當(dāng)稀釋并過0.22μm有機(jī)濾膜后用HPLC-OPA柱前衍生法進(jìn)行檢測，結(jié)果見圖9。轉(zhuǎn)化率隨溫度升高逐漸提高.當(dāng)轉(zhuǎn)化溫度達(dá)到40℃時，GAD-0和GAD-PL轉(zhuǎn)化率達(dá)到最高，分別為64.78％和82.27％，繼續(xù)升高溫度，轉(zhuǎn)化率反而降低。這是因為枯草芽孢桿菌細(xì)胞壁厚，而反應(yīng)溫度過低時，底物與胞內(nèi)酶液無法充分接觸使得轉(zhuǎn)化率低：當(dāng)反應(yīng)溫度過高時，酶與PLP穩(wěn)定性差，從而影響GABA的轉(zhuǎn)化率。

2.3.2 DH對重組菌全細(xì)胞轉(zhuǎn)化生產(chǎn)GABA的影響

以100g/L的谷氨酸為底物.溶于去離子水中，加入預(yù)處理過的濕菌體30U/g，在40℃、150r/min的水浴搖床巾進(jìn)行轉(zhuǎn)化，反應(yīng)過程中，每隔2h用0.6mol/L的H₂S0₄或NaOH調(diào)節(jié)pH，使其始終與初始pH保持一致。pH梯度設(shè)置為3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0，反應(yīng)24h后終止反應(yīng)并進(jìn)行煮沸處理，12000r/min離心5min得上清液，適當(dāng)稀釋并過0.22μm有機(jī)濾膜后用HPLC-OPA柱前衍生法進(jìn)行檢測。結(jié)果見圖10，當(dāng)pH為4.5或5.0時，GABA轉(zhuǎn)化率最高，GAD-0的GABA轉(zhuǎn)化率為75.45％和76.21％，GAD-PL的GABA轉(zhuǎn)化率為84.54％和84.21％。當(dāng)DH小于4.5時，底物-水谷氨酸鈉在酸性條件下容易酸水解生成谷氨酸析出，從而形成乳白色渾濁液體.不利于酶與底物的充分結(jié)合；當(dāng)pH大于5.0時不利于酶活性巾心的賴氨酸殘基以shifft-堿與PLP、底物結(jié)合，從而抑制GABA的生成?？梢?，酶轉(zhuǎn)化法制備GABA的pH耐受范圍窄，過酸或過堿都不利于酶促反應(yīng)進(jìn)行，考慮在高質(zhì)量濃度底物下，過低的pH更容易導(dǎo)致底物析出，所以酶轉(zhuǎn)化最適pH為5.0。

2.3.3 加菌量對重組菌全細(xì)胞轉(zhuǎn)化生產(chǎn)GABA的影響

以100g/L的谷氨酸為底物，溶于去離子水中，加入預(yù)處理過的不同濕菌體(20、30、40、50、60U/g)，在40℃、150r/min的水浴搖床中反應(yīng)24h，反應(yīng)過程中，控制pH為5.0。反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行煮沸處理，12000r/min離心5min得上清液，適當(dāng)稀釋后用氨基酸柱前衍生法進(jìn)行HPLC檢測。結(jié)果見圖11，重組菌全細(xì)胞轉(zhuǎn)化率隨著加菌量的增加而逐漸提高，其中GAD-PL和GAD-0分別在40U/g和50U/g時將底物完全轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化率達(dá)到100％。GAD-PL的加菌量少于GAD-0是因為前者細(xì)胞巾的PLP含量高于后者，PLP作為輔助因子有利于酶促反應(yīng)的進(jìn)行。
 

2.3.4 反應(yīng)時間對重組茵全細(xì)胞轉(zhuǎn)化生嚴(yán)GABA的影響

以100g/L的谷氨酸為底物，溶于去離子水中，加入預(yù)處理過的不同濕菌體，GAD-0和GAD-PL加入量分別為50U/g和40U/g，在40℃、150r/min的水浴搖床中反應(yīng)24h，反應(yīng)過程中，控制DH為5.0。反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行煮沸處理，12000r/min離心5min得上清液，適當(dāng)稀釋后用HPLC-OPA柱前衍生法進(jìn)行檢測，結(jié)果見圖12。在0～20h，GAD-0和GAD-PL轉(zhuǎn)化合成GABA的產(chǎn)量隨時問延長迅速增加，在20h時轉(zhuǎn)化率達(dá)到100％，之后隨著反應(yīng)進(jìn)行，轉(zhuǎn)化率不再發(fā)生變化。

2.3.5 底物質(zhì)量濃度對重組菌全細(xì)胞轉(zhuǎn)化生嚴(yán)GABA的影響

以200g/L的谷氨酸為初始底物，溶于去離子水中，加入預(yù)處理過的不同濕菌體，GAD-0和GAD-PL力口菌量分另0為50U/g和40U/g，在40℃、150r/min的水浴搖床中反應(yīng)6h后，每隔3h補(bǔ)加1.27g的谷氨酸同體至底物質(zhì)量濃度分別為200、250、300、350、400g/L，反應(yīng)過程中，控制pH為5.0，反應(yīng)48h。反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行煮沸處理，12000r/min離心5min得上清液，適當(dāng)稀釋并過0.22μm有機(jī)濾膜后用HPLC-OPA柱前衍生法進(jìn)行檢測。結(jié)果見圖13，當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度達(dá)到400g/L谷氨酸時，GAD-0和GAD-PL轉(zhuǎn)化生產(chǎn)GABA的轉(zhuǎn)化率分別從100％(底物質(zhì)量濃度350g/L谷氨酸)下降為97.72％和98.43％。綜合考慮，為提高工業(yè)生產(chǎn)效率和節(jié)省下游分離純化成本，選擇350g/L作為酶法制備GABA的最適底物質(zhì)量濃度。

3 結(jié)語

作者成功構(gòu)建并重組表達(dá)了含有Escherichiacoli來源的gadB基因的重組菌B.subtilis/pHY300PLK-gadB。實驗表明在發(fā)酵過程中添加0.5mmol/L輔酶前體PL的GAD總酶活達(dá)到28.14U/mL，是對照總酶活的1.72倍。進(jìn)一步優(yōu)化重組菌全細(xì)胞酶法生產(chǎn)GABA的工藝條件，結(jié)果表明，當(dāng)溫度為40℃，pH為5.0，GAD-0和GAD-PL的最適加菌量分別為50U/g和40U/g時，GABA轉(zhuǎn)化率達(dá)到100％。當(dāng)谷氨酸質(zhì)量濃度為400g/L時，GABA產(chǎn)量分別為275.60扎和273.61g/L。綜上所述，作者考察了菌體發(fā)酵培養(yǎng)過程中添加輔酶前體PL對重組菌產(chǎn)GAD及制備GABA的影響，開發(fā)了一種不需要在發(fā)酵過程和酶轉(zhuǎn)化體系巾添加昂貴輔酶PLP就能高效生產(chǎn)GABA的T藝技術(shù)，為GABA在食品和醫(yī)藥行業(yè)中的廣泛應(yīng)用打下了堅實基礎(chǔ)。

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