食用色素按其來源可分為食用天然色素和食用合成色素兩大類。食用天然色素是從有色的動、植物體內(nèi)提取，經(jīng)進一步分離精制而成。合成色素因其著色力強，易于調(diào)色，在食品加工過程中穩(wěn)定性能好，價格低廉，在食用色素中占主要地位。目前，國內(nèi)外使用的食用色素絕大多數(shù)都是食用合成色素。合成色素主要來源于煤焦油及其副產(chǎn)品，且在合成過譬皇?能受鉛、砷等有害物質(zhì)污染，因此在使用的安全性上，其爭論要比其他類的食品添加型要歲突出和尖銳。中國許可使用的合成色素有9種：莧菜紅、胭脂紅、誘惑紅、新紅、檸檬黃、日落黃、靛藍、亮藍、赤蘚紅。前6種為偶氮類化合物，使用中占絕大多數(shù)。食用合成色毒的測定方法主要有薄層色譜法和高效液相色譜法。下面介紹高效液相色譜法測定食用合成著色劑。

1、原理

食品中人工合成著色劑用聚酰胺吸附法或液-液分配法提取，制成水溶液，注入高效液相色譜儀，經(jīng)反相色譜分離，根據(jù)保留時間定性，與峰面積比較進行定量。

2、試劑

①鹽酸。

②乙酸。

③正己烷。

④甲醇：經(jīng)濾膜(O.5μm)過濾。

⑤酰胺粉(尼龍6)：過200目篩。

⑥乙酸銨溶液0.02m01/L。稱取1.54g乙酸銨，加水至1000mL溶解，經(jīng)0.45μm濾膜過濾。

⑦水取2mL氨水，加水至100mL混勻。

⑧水一乙酸銨溶液0.02mol/L。取氨水0.5mL加乙酸銨溶液(O.02mot／L)至1000mL混勻。

⑨甲醇一甲酸溶液6+4。取甲醇60mL，甲酸40mL混勻。

⑩檸檬酸溶液：取20g檸檬酸(C₆H₈0₇·H₂0)加水至100mL，溶解混勻。

?無水乙醇-氨水-水溶液7+2+1。取無水乙醇70mL、氨水20mL、水lOmL混勻。

?三正辛胺正丁醇溶液 5％。取三正辛胺5mL，加正丁醇至100mL混勻。

?飽和硫酸鈉溶液。

?硫酸鈉溶液：2g／L。

?pH6的水水加檸檬酸溶液調(diào)pH6。

?合成著色劑標準溶液準確稱取按其純度折算為100％質(zhì)量的檸檬黃、日落黃、莧菜紅、胭脂紅、新紅、赤蘚紅、亮藍、靛藍各0.100g，置于lOOmL容量瓶中，加pH6的水到刻度，配成水溶液(1.00mg／mL)。

?合成著色劑標準使用液 臨用時將上述溶液加水稀釋20倍，經(jīng)0.45μm濾膜過濾。配成每毫升相當于50.0μg的合成著色劑。

3、儀器

高效液相色譜儀，帶紫外檢測器，254nm波長。

4、操作方法

(1)樣品處理

①橘子汁、果味水、果子露汽水等：稱取20.O～40.Og放入100mL燒杯中。含二氧化碳樣品加熱驅(qū)除二氧化碳。

②配制酒類：稱取20.0～40.0g放入100mL燒杯中，加入小碎瓷片數(shù)片，加熱驅(qū)除乙醇。

③硬糖、蜜餞類、淀粉軟糖等：稱取5.00～10.OOg，粉碎樣品，放入100mL小燒杯中，加水30mL，溫熱溶解，若樣品溶液pH較高，用檸檬酸溶液調(diào)pH至6左右。

④巧克力豆及著色糖衣制品：稱取5.00～10.OOg，放入100mL小燒杯中，用水反復洗滌色素，至巧克力豆無色素為止，合并色素漂洗液為樣品溶液。

(2)色素提取

①聚酰胺吸附法：樣品溶液加檸檬酸溶液調(diào)pH為6，加熱至60℃，將1g聚酰胺粉加少許水調(diào)成粥狀，倒入樣品溶液中，攪拌片刻，以G₃垂熔漏斗抽濾，用60℃pH 4的水洗滌3～5次，然后用甲醇一甲酸混合溶液洗滌3～5次(含赤蘚紅的樣品用液一液分配法處理)。再用水洗至中性，用乙醇-氨水-水混合溶液解吸3～5次，每次5mL，收集解吸液，加乙酸中和，蒸發(fā)至近干，加水溶解，定容至5mL。經(jīng)濾膜(O.45μm)過濾，取10μL進高效液相色譜儀。

②液-液分配法(適用于含赤蘚紅的樣品)：將制備好的樣品溶液放入分液漏斗中，加2mL鹽酸、三正辛胺正丁醇溶液(5％)10～20mL，振搖提取，分取有機相，重復提取，直到有機相無色，合并有機相，用飽和硫酸銨溶液洗兩次，每次10mL，分取有機相，放蒸發(fā)皿中，水浴加熱濃縮至10mL，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，加60mL正己烷混勻，加氨水提取2～3次，每次5mL，合并氨水溶液層(含水溶性酸性色素)，用正己烷洗兩次，氨水層加乙酸調(diào)成中性，水浴加熱蒸發(fā)至近干，加水定容至5mL。經(jīng)濾膜(0.45μm)過濾，取10μL進高效液相色譜儀。

(3)高效液相色譜參考條件

①色譜柱：YWG-C_l810μm不銹鋼柱4.6mm(內(nèi)徑)×250mm。

②流動相：甲醇-O.02m01/L乙酸銨溶液(pH 4)。

③梯度洗脫：甲醇20％～35％，5min；35％～98％，5min；98％繼續(xù)6min。

④流速：1mL/min。

⑤紫外檢測器：254nm波長。

(4)測定:取相同體積樣液和合成著色劑標準使用液分別注入高效液相色譜儀，根據(jù)保留時間定性，外標峰面積法定量。

5、結(jié)果計算式中：

X_i——樣品中著色劑的含量，g/kg；

C_i——樣液中著色劑的質(zhì)量，μg；

V₂——進樣體積，mL；

V₁——樣品稀釋總體積，mL；

m——樣品質(zhì)量，g。

6、說明

①最小檢出量：新紅5ng，檸檬黃4ng，莧菜紅6ng，胭脂紅26ng。

②允許相對誤差≤10％。

③樣品不含赤蘚紅時，用聚酰胺吸附法；含赤蘚紅時，用液-液分配法

④測定一個樣品后，將甲醇流動相恢復至20％，使之穩(wěn)定20min后，再開始測定第二個樣品。

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