1 前言

銀柴胡是我國常用中藥材，為石竹科植物銀柴胡的干燥根，別名銀胡、山菜根、土參等，主要分布于寧夏、內蒙古等地。銀柴胡微寒味甘，臨床常應用于治療小兒疳積發(fā)熱、久病發(fā)熱、陰虛潮熱、感冒高熱等疾病，《證治準繩》清骨散中提到銀柴胡和其他中藥可治骨蒸勞熱，《本草匯言》中說銀柴胡治男婦虛勞發(fā)熱，或咳或不咳。銀柴胡富含甾醇類、黃酮類、揮發(fā)性物質、生物堿類和酚酸類等活性物質，具有抗炎、抗癌、擴張血管等作用。黃酮類物質有較強的抗氧化作用，具有抗衰老、抗癌，降低膽固醇，降血糖及抗炎等多種功效。目前，已有文獻報道銀柴胡具有多種黃酮類化合物，但對不同產地銀柴胡提取物中的黃酮含量及其抗氧化性研究尚未見到，本研究通過比較不同產地中黃酮的含量及其抗氧化性，為銀柴胡的進一步的應用及研究提供參考。

2 實驗材料與試劑

2.1 實驗材料

中藥材銀柴胡，分別購于寧夏回族自治區(qū)固原市隆德縣種植戶，陜西省榆林市種植戶，內蒙古自治區(qū)巴彥淖爾市五原縣種植戶。

2.2 實驗試劑

蘆丁對照品（成都德斯特生物技術有限公司，含量98%）；AB-8大孔樹脂；乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉均為分析純（國藥集團化學試劑有限公司）；純化水；濾紙（撫順市民政濾紙廠）；容量瓶、錐形瓶。

2.3 實驗儀器

酶標儀（SynergyH1，美國Biotek）；電子分析天平（AEG-220型，日本島津有限公司）；旋轉蒸發(fā)儀（RE-2000型，上海亞榮生化儀器廠）；高速離心機（ThermoSorvallLYNX4000高速落地離心機，美國Thermo）；Dragonlab移液槍（北京大龍興創(chuàng)實驗儀器有限公司）；恒溫水浴鍋（HH，金壇市金成國勝試驗儀器廠）。

3 實驗方法

3.1 銀柴胡提取物的制備

取銀柴胡藥材粉碎，過40目篩，取100g粉末加入8倍60%乙醇加熱回流3h，過濾得一次濾液，濾渣加入6倍60%乙醇加熱回流2h，過濾得二次濾液，合并兩次濾液，于25℃下6000r/min離心15min，取上清液加純水至100g；提取液用AB-8大孔樹脂吸附，80%乙醇洗脫，洗脫液低溫真空濃縮至5g，得到銀柴胡提取物，于4℃冰箱保存。

3.2 黃酮含量測定

采用紫外分光光度法。

3.2.1 對照品蘆丁標準溶液的制備

精密稱取10mg蘆丁，置于50mL容量瓶中，加60%乙醇至刻度，搖勻，制得0.20mg/mL的溶液。

3.2.2 供試品溶液的制備

稱取銀柴胡提取液1mL置于50mL容量瓶中，加60%乙醇至刻度，搖勻，再稱取上述溶液1mL置于10mL容量瓶中，加60%乙醇至刻度，搖勻，得供試品溶液。

3.2.3 標準曲線制作

分別吸取上述蘆丁標準液0.1，0.2，0.4，0.6，0.8mL于10mL容量瓶中，分別加入5%亞硝酸鈉溶液0.3mL，搖勻，靜置5min，加0.3mL的10%的硝酸鋁溶液，放置5min，再加1mol/LNaOH2mL，并用60%乙醇水溶液定容至刻度，搖勻，靜置6min，以60%乙醇溶液作為空白對照，于360nm處分別測定其吸光度（A）值。

A值為橫坐標，質量濃度為縱坐標，繪制標準曲線。

3.2.4 樣品總黃酮含量測定

吸取1mL供試樣品溶液，分別置10mL棕色量瓶中，按照“加入5%亞硝酸鈉溶液0.3mL”及之后的步驟加入試劑，于360nm處分別測定其吸光度（A）值。精密稱取樣品1mL，分別置10mL棕色量瓶中，加入60%乙醇至刻度，搖勻，得到對照組溶液，于360nm處分別測定其吸光度（A）值，根據蘆丁濃度和吸光度值得到標準曲線方程。

標準曲線回歸方程y=0.0445x-0.0057，

R²=0.9996，在0.002～0.016mg/mL范圍內線性關系良好，根據方程，可以計算銀柴胡總黃酮含量。

3.3 抗氧化能力測定

3.3.1 ABTS自由基清除能力測定

a.試劑配制

ABTS溶液：稱取0.0192gABTS（2，2′-聯(lián)氨-雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二胺鹽），加入5mL去離子水溶解混勻得到ABTS溶液。

過硫酸鉀溶液：稱取0.1892g過硫酸鉀，加入5.00mL去離子水溶解，混勻。將5mL的ABTS溶液和88µL過硫酸鉀溶液混合，在室溫避光的條件下靜置12～16h形成ABTS自由基儲備液。使用前取1000µLABTS自由基儲備液，加24mL乙醇水溶液，稀釋25倍。

b.實驗步驟

向A組試管依次加入500µL待測液，將500µL乙醇水溶液加入B組試管，加完試劑及時蓋帽，渦旋混勻。將500µLABTS自由基儲備溶液依次加入A試管和B試管中，加完試劑及時蓋帽，渦旋混勻，反應10min后在734nm檢測A組吸光值和B組吸光值。向C組試管依次加入500µL待測液和500µL乙醇水溶液渦旋混勻，734nm處測吸光值，陽性對照為抗壞血酸。

c.計算方法
 

式中：OD_A為加樣品溶液的吸光度值；

OD_B為加乙醇水溶液的吸光度值；

OD_C為不加ABTS自由基儲備液的吸光度值。

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