“蝦醬”是中國沿海地區(qū)及東南亞地區(qū)人們常用的調(diào)味料之一，是以毛蝦等小型蝦類經(jīng)腌制、搗碎、發(fā)酵制成的糊狀食品，其滋味鮮美，回味無窮，具有獨特的風味。我國的蝦醬生產(chǎn)主要集中在沿海地區(qū)，如遼寧、山東、天津、江蘇、廣東、海南等。

蝦醬的發(fā)酵是一個較為復雜的化學變化過程，傳統(tǒng)的蝦醬生產(chǎn)通常采用自然發(fā)酵，且發(fā)酵過程受到季節(jié)、天氣、溫度等諸多不可控因素影響，使蝦醬的生產(chǎn)周期長，品質(zhì)不穩(wěn)定，不利于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。國內(nèi)外專家、學者對不同地區(qū)的蝦醬發(fā)酵工藝及品質(zhì)進行研究。如：吳帥等研究了低值蝦醬發(fā)酵中的風味變化；苑寧等闡述了蝦醬生產(chǎn)過程中的品質(zhì)變化，以及容易引起食品安全問題的不良因素。還有一部分學者對蝦醬中的微生物進行分離，例如：石敏等從侗族傳統(tǒng)蝦醬分離獲得一些具有蛋白酶、脂肪酶以及其它酶類的活性乳酸菌；孫業(yè)盈等從蜢子蝦醬中分離鑒定出1株中度嗜鹽菌MKY2；連鑫等從李錦記公司提供的廣東傳統(tǒng)發(fā)酵蝦醬中分離鑒定出產(chǎn)香酵母和產(chǎn)蛋白酶霉菌；呂欣然等在錦州傳統(tǒng)蝦醬中分離出蛋白酶嗜鹽菌。大連因處于黃、渤海交界海域這一獨特的地理位置，故造就了大連傳統(tǒng)蝦醬與眾不同的風味和口感，這與其自身特有微生物環(huán)境有著密切聯(lián)系。過去對傳統(tǒng)蝦醬中酵母菌多樣性及特性的研究甚少，也鮮有對酵母菌碳源同化利用特性的研究。

本研究通過對大連蝦醬中酵母菌的分離純化，采用26SrDNA菌株進行種屬鑒定，對所分離的酵母進行碳源同化特性研究，所得結(jié)果對蝦醬發(fā)酵優(yōu)良菌株的篩選以及工藝優(yōu)化有重要意義。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

樣品蝦醬，大連竹島食品公司的生制蝦頭醬。

1.2 培養(yǎng)基與試劑

YEPD培養(yǎng)基：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，酵母10g/L，pH6.0，121℃滅菌20min。
碳源同化培養(yǎng)基：硫酸銨5g/L，磷酸二氫鉀1g/L，七水硫酸鎂0.5g/L，酵母粉0.5g/L，瓊脂粉15g/L，碳源（葡萄糖、甘油、乳糖、蔗糖、檸檬酸、殼聚糖、甘露醇、山梨糖醇、N-乙酰-D-氨基葡萄糖）20g/L，pH5.8～6.0，121℃滅菌20min。

甘露醇（分析純）、殼聚糖（分析純）、甘油（分析純），天津市光復精細化工研究所；N-乙酰-D氨基葡萄糖，上海晨易生物科技有限公司；D-山梨糖醇，生工生物工程（上海）有限公司；檸檬酸，天津市石英鐘廠霸州市化工分廠；蔗糖（分析純）、乳糖（分析純）、葡萄糖（分析純），天津市福晨化學試劑廠。

1.3 儀器與設(shè)備

DRP-9162電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海森信實驗儀器有限公司；超凈工作臺，上海博迅實業(yè)有限公司；PCR儀，美國伯樂公司；高壓蒸汽滅菌鍋，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；凝膠成像系統(tǒng)，以色列DNR公司。

1.4 方法

1.4.1 酵母菌的分離純化

在無菌條件下，取5g蝦醬于45mL無菌水中搖勻，過濾。取合適的梯度進行稀釋，稀釋后溶液取0.2mL，均勻涂布于PDA培養(yǎng)基平板上，封口后置于30℃培養(yǎng)48h。選取菌落數(shù)為30～300的平板，挑取清晰單菌落或不聚成堆菌落重新平板劃線分離，培養(yǎng)一定時間后，挑取單菌落，在PDA平板上劃線純化，直至得到純種單菌落，觀察并記錄菌落形態(tài)，置于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 菌株的形態(tài)學鑒定

觀察分離純化后酵母菌的菌落形態(tài)特征，從顏色、光滑度、致密性等方面觀察并記錄。取典型菌落進行鏡檢，于40倍物鏡下觀察菌體形態(tài)并采集圖像。

1.4.3 酵母菌的碳源同化

共配制9種碳源同化培養(yǎng)基，9種碳源包括葡萄糖、甘油、乳糖、蔗糖、檸檬酸、殼聚糖、甘露醇、山梨糖醇、N-乙酰-D-氨基葡萄糖。

將分離純化后的酵母菌分別接種于9種培養(yǎng)基平板上，30℃培養(yǎng)相同時間，取出后觀察各培養(yǎng)基上每種酵母菌的生長狀況，進行對比，總結(jié)每種酵母菌適宜的碳源生長條件，并采集圖像。

1.4.4 菌株基因組的提取

取保藏在-20℃的菌株，加入1mL純凈水懸浮，13000r/min離心30s。再加入400μLTES和0.3g左右的玻璃珠，室溫放置5min。冰浴1min，用渦旋振蕩儀（最大功率）振蕩1min，反復5次。再加入200μL飽和酚溶液，200μL氯仿異戊醇，室溫作用5min。冰浴1min，振蕩1min，反復5次。13000r/min4℃離心10min。取上清，加入1/10體積的3mol/L醋酸鈉，2倍體積冰冷無水乙醇，-20℃沉淀20～60min。13000r/min4℃離心10min，棄上清，加入1mL75%乙醇，顛倒反復洗滌沉淀，13000r/min離心2min，棄上清，晾干。加入適量的TER（1mLTE緩沖液中加入1μL10μg/μL的RNA酶），37℃溫育20min。取1μL進行電泳，與λHindⅢmarker電泳條帶進行比較，采用凝膠成像儀觀察并采集圖像。

1.4.5 菌株26SrDNAPCR擴增

PCR采用通用引物26S1：5’-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3’，26S2：5’-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3’進行擴增。

PCR反應體系（50μL）：10×PCRBuffer5μL，dNTP4μL，Taq酶0.5μL，模板2μL，超純水36.5μL。PCR反應條件：94℃5min；94℃20s，50℃30s，72℃1min，30個循環(huán)；72℃10min；4℃∞。取PCR產(chǎn)物5μL進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.4.6 DNA測序及系統(tǒng)發(fā)育樹建立

PCR產(chǎn)物的測序工作由生工生物工程（上海）有限公司完成。將所得序列在NCBＩ數(shù)據(jù)庫中進行BLAST同源性比對分析，得到序列后用軟件MEGA5.2進行分析，制作成系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 蝦醬中酵母菌的分離與鑒定

2.1.1 菌落的形態(tài)學觀察結(jié)果

以大連傳統(tǒng)蝦醬為原材料，以PDA為培養(yǎng)基，共分離純化出8株酵母菌。該8株酵母經(jīng)過多次平板劃線分離純化，確定為純菌落，分別編號為Y1，Y2，Y3，Y4，Y5，Y6，Y7，Y8。對以上8株酵母菌進行形態(tài)學觀察和顯微鏡檢測，菌落形態(tài)及鏡檢結(jié)果如圖1所示，各自具體菌落形態(tài)學描述見表1。由圖1可見，這8株菌株中有2株菌為紅色，從菌落形態(tài)上看，表面光滑，不透明，產(chǎn)生紅色色素。其余均為白色，表面光滑濕潤，不透明，多呈白色，菌落的透明度、顏色都有所差異，其中，有2株白色菌株的菌落邊緣呈模糊狀態(tài)。通過鏡檢可知，所分離的菌株大小符合酵母菌的大小，可進一步采用分子生物學的方法對其進行鑒定。

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