單核細(xì)胞增生李斯特菌（Listeriamonocytogenes）是食品中重要的致病性微生物，也是李斯特菌屬內(nèi)能引起腸胃炎、敗血病、腦膜炎和李斯特菌病等最主要的病原體，致死率達(dá)30%，對(duì)免疫缺陷人群危害嚴(yán)重。該菌廣泛存在于乳制品、肉制品、蔬菜水果和海產(chǎn)品等各類食品中，能在pH4.0、高鹽和4℃環(huán)境中存活并繁殖。

單核細(xì)胞增生李斯特菌的生長易被其同屬內(nèi)的其它細(xì)菌（如英諾克李斯特菌等）掩蓋，較難在培養(yǎng)后分離獲得目標(biāo)菌，導(dǎo)致假陰性檢測結(jié)果。免疫磁珠捕獲技術(shù)（Immuno-magneticbeadstechnology，IMBs）可在復(fù)雜體系中特異性地捕獲目標(biāo)微生物，獲得活菌體。IMBs的特異性依賴于所用抗體的性能，而抗體受制于生產(chǎn)工藝，其質(zhì)量與產(chǎn)量都不穩(wěn)定。與傳統(tǒng)免疫血清、雜交瘤等抗體制備技術(shù)相比，噬菌體展示技術(shù)（phagedisplaytechniques）通過噬菌體庫與目標(biāo)菌的特異性結(jié)合，篩選獲得高特異性的表面單鏈抗體片段（single-chainantibodyfragments，scFvs）。將表達(dá)特性蛋白的基因轉(zhuǎn)移至質(zhì)粒內(nèi)，可穩(wěn)定保存并大規(guī)模生產(chǎn)具有相同特性的單鏈抗體。

前期有研究報(bào)道一種對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特菌具有高特異性的噬菌體展示單鏈抗體片段的制備方法。本研究基于該片段的特異性，制備親和素偶聯(lián)的scFv免疫磁珠（scFv-IMBs）。通過在多種增菌培養(yǎng)體系中的定性、定量檢測，考察scFv-IMBs對(duì)不同李斯特菌屬細(xì)菌的特異性捕獲情況，評(píng)價(jià)scFv-IMBs在人工污染的法蘭克福香腸中分離單核細(xì)胞增生李斯特菌和英諾克李斯特菌的能力。

1材料與方法

1.1菌株及培養(yǎng)條件

試驗(yàn)使用了14株單核細(xì)胞增生李斯特菌和9株其它李斯特菌屬細(xì)菌（表1）。菌種復(fù)蘇于腦心浸液（BHI）培養(yǎng)基（BDDiagnostics，Sparks，MD）中，置37℃振蕩培養(yǎng)過夜，振蕩速度為250r/min。選擇RAPIDL.MonoAgar（Bio-Rad，CA）作為李斯特菌顯色培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基上單核細(xì)胞增生李斯特菌顯藍(lán)紫色，伊氏李斯特菌顯藍(lán)綠色，英諾克等其它李斯特菌顯白色。市售李斯特菌免疫磁珠Dynabeadsanti-Listeria（Dyna-IMBs），購自ＴhermoScientific。
 

1.2抗體磁珠的制備

按已報(bào)道的方法采用含pBAD：A8質(zhì)粒的大腸埃希菌（E.coliAＶB100）制備生物素標(biāo)記的scFv抗體。以含0.3%的L-阿拉伯糖和1mmol/L異丙基硫代半乳糖苷（IPＴG）進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，用弗氏細(xì)胞破碎儀獲得裂解液，經(jīng)離心、層析和過濾純化得到含生物素標(biāo)記的scFv清液。

取鏈霉親和素標(biāo)記的DynabeadsM280磁珠100μL（ＴhermoScientific），加入PBS緩沖液（20mmol/L磷酸鹽，150mmol/LNaCl，pH7.4）900μL，混勻。置磁力架上振搖收集磁珠，棄去液體。將磁珠分散于含0.1%牛血清蛋白的PBS緩沖液（以下簡稱PBS緩沖液）中活化。取約10μg生物素標(biāo)記的scFv抗體，加入活化的磁珠體系中（濃度約為7×109～9×109個(gè)/mL），室溫振蕩1h。在磁力架上穩(wěn)定3min，用PBS緩沖液反復(fù)清洗4次，分散于1mLPBS緩沖液中，制備成scFv結(jié)合的免疫磁珠（scFv-IMBs），置4℃保存。

1.3細(xì)菌基因組DNA提取及PCR檢測

DNA提取選用DNeasyBloodandＴissueKit試劑盒（QIAGEN，Maryland，US），按說明書操作。DNA溶解于100μLＴE緩沖液中，-20℃保存。

從5對(duì)備選李斯特菌特異性PCR引物（表2）中篩選單核細(xì)胞增生李斯特菌特異性擴(kuò)增引物。

反應(yīng)體系為：模板溶液1μL，DNA聚合酶1U（GoＴaqDNApolymerase，Promega，WI），1×PCR緩沖液，MgCl2濃度1.5mmol/L，dNＴP濃度各0.25mmol/L，上下游引物各50nmol/L，加純水至25μL。用iQ5實(shí)時(shí)熒光定量系統(tǒng)（Bio-Rad，CA），反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，51℃退火40s，72℃延伸40s，共30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸5min。以1.0%瓊脂糖凝膠電泳分析擴(kuò)增產(chǎn)物6μL，在150Ｖ電壓的1×ＴAE緩沖液（Ｔrisacetate-EDＴAbuffer）中電泳20min，用10μg/mLEB染料（ethidiumbromide）染色15min后，置紫外凝膠成像儀（MultiImageLightCabinet，Alphalmager）觀察。標(biāo)準(zhǔn)DNA分子質(zhì)量采用ExactGene（lowRangeDNAladder，F(xiàn)isherBioReagents，NY），以單核細(xì)胞增生李斯特菌AＴCC19115基因組DNA為陽性對(duì)照，純水為空白對(duì)照。

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