幾丁質是在自然界中含量僅次于纖維素的天然生物大分子，主要存在于海洋無脊椎動物、昆蟲的殼及真菌的細胞壁。幾丁質化學結構穩(wěn)定，溶解性差，導致應用受限。幾丁質脫去一定程度的乙?；玫綒ぞ厶恰ぞ厶呛写罅康挠坞x氨基和堿性陽離子，溶解性提高，生物相容性好，應用廣泛，導致全球市場上殼聚糖供不應求。

目前，殼聚糖的制備方法有化學法和生物法?；瘜W法利用濃堿熱解處理幾丁質，使其脫去其中的乙酰基，是工業(yè)上廣泛使用的方法。但是，化學法產物品質不受控制，并會引起嚴重的環(huán)境污染問題。生物法，反應條件溫和，催化過程易控，而且解決了化學法造成的環(huán)境污染問題，極具應用潛力。但生物法尚未工業(yè)大規(guī)模利用，原因是其方法應用的瓶頸問題是幾丁質對聚合度較高的脫乙酰酶(Chitindeacetylase，CDA)活性不高。

目前報道的幾丁質脫乙酰酶多產于真菌。真菌幾丁質脫乙酰酶對真菌的營養(yǎng)、真菌細胞壁的合成和完整、芽孢的形成等起到關鍵作用，但是發(fā)酵水平較低，難以應用。細菌產幾丁質脫乙酰酶報道較少，且報道的菌株中大部分分泌的幾丁質脫乙酰酶只催化寡聚幾丁質脫乙酰。海洋微生物豐富多樣，本研究從海洋樣品中篩選幾丁質脫乙酰酶產生菌，對菌株進行鑒定，對發(fā)酵條件進行優(yōu)化，為該菌株的進一步應用奠定基礎。

一、材料與方法

1、材料與儀器

樣品來源：海泥樣品采集于連云港高公島碼頭；富集培養(yǎng)基：幾丁質2.5g／L、K₂HP0₄0.7g／L、KH₂P0₄0.3g／L、MgS0₄0.5g／L，陳海水配置，pH7.0；平板篩選培養(yǎng)基：幾丁質2g／L、K₂EHPO₄0.7g／L、KH₂P0₄0.3g／L、MgS0₄0.5g/L、對硝基乙酰苯胺0.2g／L、瓊脂20g／L，陳海水配置，pH7.0；種子培養(yǎng)基：蛋白胨5g／L、酵母粉lg／L，陳海水配置，pH7.0；發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨lOg／L、ZnSO₄0.5g／L、木薯淀粉11g／L，陳海水配置，pH7.9。
SW-CJ-1D超凈工作臺：蘇州凈化設備有限公司；分光光度計：杭州明基科學儀器有限公司；SPX-250B-2生化培養(yǎng)箱：上海博迅實業(yè)有限公司；DK-8D電熱恒溫水槽：上海-恒科技有限公司；Nikon90i全電動顯微鏡：上海普赫光電科技有限公司。

2、實驗方法

（1）產幾丁質脫乙酰酶海洋細菌的篩選

初篩：稱取lg泥樣，加入富集培養(yǎng)基，在30℃、180r／min培養(yǎng)72h。取富集培養(yǎng)液100uL均勻涂布于篩選培養(yǎng)基，30℃、培養(yǎng)3～5d，挑取周圍出現(xiàn)明顯黃色圈的菌落，在LB培養(yǎng)基中進一步劃線純化并保存。

復篩：將初篩得到的菌株分別接到種子液中，30℃、180r／min搖床培養(yǎng)24h，再以1％的接種量將種子液接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃、180r／min搖床培養(yǎng)72h，取上清為粗酶液并進行酶活力測定和催化α-幾丁質脫乙酰的測定。選取酶活力較高，并能催化幾丁質脫乙酰的菌株進行進一步研究。

酶活性和催化α-幾丁質脫乙酰的測定按照報道的方法進行。酶活單位(U)定義：在上述反應條件下每小時產生對硝基苯胺所需要的酶量定義為一個酶活力單位。

（2）菌株MCDA02的鑒定

根據(jù)伯杰氏細菌手冊對MCDA02進行形態(tài)學及生理生化鑒定。用Axygen試劑盒提取MCDA02的基因組DNA作為PCR擴增模板，16SrDNA通用引物采用27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，1492R：5’GGTTACCTTGTTACGACTT-3’，反應體系為：PCRmix(12.5μL)，上下游引物(各lgL)，DNA模板(2μL)，水(9.5μL)。反應程序：94℃變性5min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸90s，32個循環(huán)；72℃終延伸10min。PCR產物送至南京思普金公司測序。序列測定后，提交GenBank數(shù)據(jù)庫并進行BLAST比較分析，利用MEGA7軟件進行同源性分析，構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

（3）單因素優(yōu)化菌株MCDA02發(fā)酵產CDA培養(yǎng)基

在原發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎上，保證接種量l％、30℃、裝液量20％、180r／min發(fā)酵72h的發(fā)酵條件不變，改變培養(yǎng)基中的碳源：葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖、豌豆粉、玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、木薯淀粉，氮源：蛋白胨、尿素、牛肉膏、豆粕、玉米漿(干粉)、米糠、花生粕、麩皮、NaN0₃、NH₄C1、(NH₄)₂S0₄，無機鹽：MgS0₄、CuS0₄、CaCl₂、NaH₂P0₄、KH₂P0₄、MnS0₄、ZnS0₄、BaCl₂、FeCl₃，分別取樣測定酶活力，確定最佳碳源、氮源及無機鹽。

（4）單因素優(yōu)化菌株MCDA02發(fā)酵產CDA發(fā)酵條件

確定最佳發(fā)酵培養(yǎng)基后，將種子液以l％接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，30℃、裝液量20％、180r／min發(fā)酵96h，每隔12h取樣測酶活力，確定最佳發(fā)酵時間；將種子液以1％接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，裝液量20％、180r／min，在不同溫度下培養(yǎng)72h，取樣測定酶活力，確定最佳發(fā)酵溫度；將種子液以1％接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，30℃、裝液量20％、180r／min，調節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基不同初始pH，培養(yǎng)72h后測定酶活力，確定最佳培養(yǎng)基起始pH；將種子液以1％接種量接種至不同裝液量發(fā)酵培養(yǎng)基，30V、180r／min，培養(yǎng)72h后測定酶活力，確定最佳裝液量；將種子液以不同接種量接種至裝液量為20％的發(fā)酵培養(yǎng)基，30℃、180r／min，培養(yǎng)72h后測定酶活力，確定最佳接種量。

（5）響應面優(yōu)化菌株MCDA02發(fā)酵產CDA發(fā)酵條件

根據(jù)單因素實驗結果，選取對產酶影響最顯著的三個變量為因變量，進行三因素三水平響應面實驗設計，優(yōu)化發(fā)酵條件。

3、數(shù)據(jù)處理與分析

每組試驗設置3組平行，重復試驗3次，試驗結果用平均值±標準方差(n=3)表示，采用Origin2018作圖，響應面采用DesignExpert10進行統(tǒng)計分析。

二、結果與分析

1、幾丁質脫乙酰酶產生菌的篩選

通過變色圈法總共篩選得到了3株有變色圈的菌株，將這些菌株進行劃線分離純化，保存于斜面培養(yǎng)基中，置于4℃冰箱保存。將初篩得到的菌株接入種子培養(yǎng)液中，30℃搖床培養(yǎng)24h后，以1％的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)72h，分別測定其酶活力。選取酶活力最高的作為實驗菌株，即為MCDA02。

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